LysM結(jié)構(gòu)域在植物識(shí)別病原菌入侵并激發(fā)植物免疫防御方面具有重要作用。目前已在原核生物和真核生物基因組內(nèi)鑒定到大量LysM結(jié)構(gòu)域基因,但迄今為止未在古菌中發(fā)現(xiàn)LysM結(jié)構(gòu)域基因的存在。隨著近幾年高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展,大量古菌基因組序列被測(cè)定,古菌中是不是存在LysM結(jié)構(gòu)域基因?如存在,其功能是否與植物免疫防御相關(guān)?基于這些疑問(wèn),本研究通過(guò)收集公共數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的古菌基因組序列信息,挖掘古菌基因組中的LysM結(jié)構(gòu)域基因并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析;選取具有代表性的古菌LysM結(jié)構(gòu)域基因利用原核表達(dá)進(jìn)行功能分析;同時(shí)在擬南芥LysM結(jié)構(gòu)域功能缺失突變體中異源表達(dá)探究其真菌病原菌識(shí)別激發(fā)植物免疫反應(yīng)功能特性。對(duì)古菌LysM結(jié)構(gòu)域基因的研究對(duì)于植物L(fēng)ysM基因的起源具有重要的理論意義,同時(shí)在作物抗逆育種中也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。主要研究結(jié)果如下:1.利用NCBI和Ensembl Bacteria網(wǎng)站獲得了441種無(wú)冗余的已測(cè)序古菌基因組序列,通過(guò)功能結(jié)構(gòu)域分析,從中鑒定到27種古菌含有LysM結(jié)構(gòu)域,從而證實(shí)古菌中同樣存在LysM結(jié)構(gòu)域。2.根據(jù)這些古菌的分類信息以及鑒定到的LysM結(jié)構(gòu)域蛋白的氨基酸序列信息,推斷出古菌的LysM結(jié)構(gòu)域主要存在于廣古菌門(mén)中,且LysM結(jié)構(gòu)域主要位于相關(guān)蛋白氨基酸序列的C端。3.構(gòu)建Halobiforma_nitratireducens古菌的LysM結(jié)構(gòu)域基因(HnLysM)的原核表達(dá)載體,通過(guò)Western blot證實(shí)其表達(dá)后進(jìn)行蛋白純化,多糖結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)其幾丁質(zhì)特異性結(jié)合活性,但是酶活分析表明其不具有幾丁質(zhì)酶活性。4.構(gòu)建植物表達(dá)載體,將HnLysM在擬南芥LysM結(jié)構(gòu)域功能缺失突變體cerk1-2中異源表達(dá),玉米長(zhǎng)蠕孢菌接種實(shí)驗(yàn)顯示突變體與轉(zhuǎn)基因株系受真菌侵染程度無(wú)明顯差異,表明HnLysM并沒(méi)有恢復(fù)AtCERK1的幾丁質(zhì)觸發(fā)植物免疫反應(yīng)功能。本研究初步表明古菌中LysM結(jié)構(gòu)域基因功能完全不同于真菌同源基因的幾丁質(zhì)水解功能及植物同源基因的免疫防御識(shí)別功能,其功能有待進(jìn)一步分析。
【學(xué)位單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：Q933
【部分圖文】：

物主要分為 3 大領(lǐng)域，即真核生物域（Eucarya）、細(xì)菌chaea）[1]。細(xì)菌和古菌都屬于原核生物，二者的細(xì)胞核和核沒(méi)有核膜包裹，染色體呈環(huán)狀，而二者的不同在于細(xì)菌菌不含有肽聚糖[2]。Woese 等通過(guò)對(duì)真核生物、細(xì)菌、古許多來(lái)自極端環(huán)境下的微生物具有既不同于真核生物也，于 1990 年首次提出了“三域?qū)W說(shuō)”[3]。后續(xù)的相關(guān)研究錄、翻譯和剪接又和真核生物類似，認(rèn)為細(xì)菌和古菌與真——原始細(xì)胞（Progenote），而細(xì)菌首先從古菌和真核生圖 1.1）[4]。此外對(duì)極端微生物的分離和宏基因組的探究育有了一個(gè)較全面的認(rèn)知和理解[5]。古菌不僅與其它生物的生物具有十分廣泛的生物多樣性[6, 7]。按照 16S rRNA泉古菌門(mén)（Crenarchaeota）、廣古菌門(mén)（Euryarchaeotta）、奇古菌門(mén)（Thaumarchaeota）和初古菌門(mén)（Korar

通常由富含 Ser、Thr、Asp、Pro 的序列相連，從而有助于在這些結(jié)構(gòu)域之間形對(duì)靈活的區(qū)域[20, 21]。在原核生物中，LysM 結(jié)構(gòu)域蛋白主要靠形成大量的二級(jí)結(jié)例如α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角等)和氫鍵形成穩(wěn)定的三級(jí)結(jié)構(gòu)；而真核生物中的 Ly構(gòu)域則主要依靠二硫鍵來(lái)保持其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[22]。相關(guān)研究表明，LysM 結(jié)構(gòu)域與超過(guò) 50 種結(jié)構(gòu)域組合形成不同的蛋白結(jié)構(gòu)域骨架，其中最常見(jiàn)也是最簡(jiǎn)單的只含有 1 個(gè) LysM 結(jié)構(gòu)域，基本存在于所有物種中[22]，而另一種最常見(jiàn)的則含有LysM結(jié)構(gòu)域和1個(gè)肽酶結(jié)構(gòu)域，這種主要存在于原核生物以及非微管類植物中[1

序列分別與 3.2.1 下載的古菌基因組序列逐一對(duì)比，從不同古菌中篩選 結(jié)構(gòu)域的序列。 古菌 LysM 結(jié)構(gòu)域蛋白氨基酸序列分析方法于 3.2.2 獲得的相應(yīng)氨基酸序列，刪除重復(fù)后利用 clastal W 軟件和 DN行序列比對(duì)和同源性分析，利用 MEGA6.0 軟件基于 Poisson correction進(jìn)化樹(shù)（Neighbor-Joining tree）。選取目的基因片段后，利用 Sig://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）在線網(wǎng)站進(jìn)行分泌性信號(hào)肽預(yù)M Server v. 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在線網(wǎng)站進(jìn)預(yù)測(cè)分析。 原核表達(dá)核表達(dá)載體構(gòu)建方法研究中用到的原核表達(dá)載體為 pET-28b(+)，其載體圖譜如圖 3.1 所示。
【參考文獻(xiàn)】

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1 季東超;宋凱;邢晶晶;陳彤;田世平;;LysM蛋白介導(dǎo)植物免疫防衛(wèi)反應(yīng)及其信號(hào)激發(fā)的研究進(jìn)展[J];植物學(xué)報(bào);2015年05期

2 江聰;黃敏仁;徐立安;;LysM結(jié)構(gòu)域及其與植物-真菌相互作用的關(guān)系[J];植物學(xué)報(bào);2014年02期

3 康樂(lè);王海洋;;我國(guó)生物技術(shù)育種現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢(shì)[J];中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào);2014年01期

4 李曙光;皮昀丹;Zhang Chuan-lun;;古菌研究及其展望[J];中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)學(xué)報(bào);2007年08期

5 鄭天凌;田蘊(yùn);蘇建強(qiáng);李可;劉慧杰;楊小茹;鄭偉;王桂忠;李少菁;;海洋微生物研究的回顧與展望[J];廈門(mén)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2006年S2期

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1 陳文超;嗜鹽古生菌hsp70基因的表達(dá)及其功能研究[D];武漢大學(xué);2015年

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1 潘艷會(huì);嗜鹽古菌MnSOD基因在水稻中表達(dá)及其耐鹽性研究[D];浙江大學(xué);2011年

2 余強(qiáng)毅;APEC地區(qū)糧食綜合生產(chǎn)能力與糧食安全研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2010年

本文編號(hào)：2885724