細胞分裂素(CKs)是一類重要的植物激素,在細胞分裂、頂端優(yōu)勢、葉片衰老、根的形成和生長、果實發(fā)育、以及適應逆境等多個方面發(fā)揮重要作用,但目前關于CKs在果實成熟方面的調控還未見報道。異戊烯基轉移酶(isopentenyl transferase,IPT)是CKs合成的限速酶,催化CKs合成的第一步,不同的IPT基因可能調控不同的CKs合成。因此,研究IPT基因的生物學功能對揭示CKs的調控機制具有重要意義。番茄紅素是一種重要的類胡蘿卜素,在番茄果實成熟過程中大量積累,并賦予果實鮮艷的紅色,是番茄果實成熟的重要特征之一。番茄紅素合成和分解代謝過程受到很多因素的調控(包括植物激素),但是對其合成的具體調節(jié)機制還知之甚少。本研究分析了CKs合成基因SlIPT4在番茄中的表達特征以及其對不同激素處理和逆境脅迫的響應。同時,通過超表達和RNAi技術對其生物學功能進行了分析。主要研究結果如下:(1)利用RT-PCR技術對SlIPT4進行表達模式分析,結果表明,SlIPT4在嫩葉中具有較高的表達,隨著葉片的成熟和衰老,其表達量逐漸降低;在坐果期的子房中(-2 dpa-4 dpa)SlIPT4大量積累,但在青熟期的果實中SlIPT4保持較低的表達水平,隨著果實成熟SlIPT4表達量迅速增加,在破色期到紅果期增速最為明顯,表明SlIPT4可能在番茄葉片衰老、果實前期發(fā)育以及成熟過程中發(fā)揮重要調控作用。(2)SlIPT4對不同激素和逆境處理的響應分析表明:生長素(IAA)、乙烯合成前體ACC和乙烯合成抑制劑AgNO_3處理對SlIPT4的表達幾乎無影響,而生長素抑制劑NPA處理增強SlIPT4基因的表達;脫落酸(ABA)能明顯地抑制SlIPT4的表達;干旱脅迫、鹽脅迫和水脅迫均能抑制SlIPT4的表達。這些結果表明,SlIPT4可能參與番茄非生物脅迫的適應過程,并受ABA調節(jié)。(3)構建SlIPT4的超表達和沉默載體,利用農桿菌介導的方法分別轉化番茄子葉,獲得SlIPT4超表達和沉默轉基因株系。表型分析發(fā)現(xiàn),SlIPT4超表達株系與野生型植株間的差異不明顯,而SlIPT4沉默株系展現(xiàn)出明顯的表型變化。(4)SlIPT4沉默導致番茄葉片加速衰老、葉片中葉綠素含量降低、葉綠素合成正調控基因GLK2表達下調、葉綠素降解正調控基因SGR表達上調、光合作用正調控基因Rbcs3A表達下調,表明SlIPT4可能通過調節(jié)番茄葉片中葉綠素的合成及代謝來調控葉片衰老過程。(5)SlIPT4沉默造成永不變紅的橙色果實。色素測定表明,SlIPT4沉默株系的果實中總類胡蘿卜素以及番茄紅素含量均明顯降低。定量PCR分析表明,SlIPT4沉默導致果實中類胡蘿卜素合成基因ZISO和ZDS下調表達(ZISO下調最為明顯,表達量僅為野生型的20%左右),其他番茄紅素合成相關基因(PSY1,PDS,CRTISOs)均上調表達。這些結果表明,SlIPT4可能通過調控ZISO的表達來調控番茄紅素的合成。(6)ABA是番茄紅素主要的降解產物之一,在植物適應逆境過程中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)沉默株系的番茄果實中ABA含量明顯低于野生型番茄果實,暗示沉默株系果實中番茄紅素的降低不是由于其降解過程增強,而是由于其合成受阻造成的。定量結果表明,ABA合成相關基因(ZEP、NCED1和NCED2)均上調表達,這一結果與類胡蘿卜素合成途徑中上游基因PSY1和PDS的上調表達相一致,驗證了ABA與類胡蘿卜素(番茄紅素)合成之間負反饋調控方式的存在。綜上所述,本研究明確了SlIPT4在番茄葉片衰老以及果實番茄紅素生物合成調控網絡中發(fā)揮重要的作用,對揭示CKs調控葉片衰老以及番茄紅素合成的調控機制具有積極的意義。
【學位單位】：重慶大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S641.2;Q943.2
【部分圖文】：

圖 1.1 細胞分裂素結構Figure 1.1 The structures of cytokinins① CKs 的生物學合成目前已知的 CKs 合成途徑有兩條：從頭合成和 tRNA 降解途徑（圖 1.2）[6由于在大多數生物體內，CKs 通過與 tRNA 結合的方式存在，且降解途徑釋放的cZ 能經順反異構酶轉化為有活性的 tZ[7]，因此，曾一度認為 CKs 的合成是通過tRNA 降解途徑實現(xiàn)。但最近的研究表明，cZ 和 tZ 之間的轉換發(fā)生的頻率很低，這與植物體內 CKs 的大量存在相矛盾。因此，目前普遍認為在植物 CKs 的合成中，從頭合成是主要途徑，tRNA 降解是次要途徑[5]。CKs 的從頭合成途徑最初是在盤基網柄菌（Dictyostelium discoideu）中發(fā)現(xiàn)[8]。異戊烯基轉移酶（isopentenyltransferase，IPT）是 CKs 從頭合成途徑的限速酶，催化二甲基丙烯基二磷酸（DMAPP）的異戊烯基轉移到腺苷酸（AMP）的 N6位置上，生成異戊烯基腺苷磷酸。IPT 基因最先從根瘤農桿菌中（Agrobacteriutumefaciens）鑒定出來，命名為 tmr，tmr 基因突變導致植物根部產生類似根瘤的結

對 tZ 含量影響較��；干擾其他 7 個 IPT 基因的表達能顯著的降低 tZ 及其衍水平，且在大腸桿菌中表達這 7 個基因能導致 iP 和玉米素的分泌[9]。另外， 35S 強啟動子超表達 AtIPT4 和 AtIPT2 發(fā)現(xiàn)，導入 AtIPT4 的愈傷組織在無外胞分裂素的條件下仍能正常的分化，而導入 AtIPT2 的愈傷組織需外源施加細裂素才能誘導分化[11]。在高等植物體內，CKs 從頭合成途徑的主要初始產物是 iP 核苷酸，例如，異基腺苷 -5'- 三磷酸（iPRTP）和異戊烯基腺苷 -5'- 二磷酸（iPRDP），這是由 AMP、ATP 和 ADP 同時存在的情況下，植物 IPTs 優(yōu)先利用 ATP 和 ADP[4]。苷酸可在細胞色素 P450 單加氧酶（CYP735A1 和 CYP735A2）的催化下轉化Z 核苷酸[12]。iP 和 tZ 形式的核苷酸轉變?yōu)榫哂猩锘钚�、自由形態(tài)的 CKs 需過兩步催化反應，但其對應的編碼核苷酸酶和核苷酶的基因目前為止還未被出來。在水稻突變體的研究中發(fā)現(xiàn)，核苷酸形態(tài)的 CKs 可以通過 LONELYY（LOG）家族蛋白直接催化為有活性的游離態(tài) CKs[13]。

圖 1.3 細胞分裂素信號轉導模式圖[14]Figure 1.3 The model of cytokinin signal[14].1.2 類胡蘿卜素的生物合成及調控類胡蘿卜素是一類含有 40 個碳原子的類異戊二烯聚合物，可由所有的光合以及一些非光合作用的細菌和真菌合成[19]。類胡蘿卜素往往具有特有的顏色（到紅色范圍），這是由于共軛雙鍵的數目不同造成的，一般共軛雙鍵的數目越多色越偏向紅色[20]。在植物中，類胡蘿卜素不僅行使色素功能，還在光合作用過程中發(fā)揮重要作收集（吸收 450-570 nm 的光能增強植物的光合作用）和光保護（使過量的光離葉綠體）[21, 22]。此外，類胡蘿卜素還可以為植物激素（ABA、JA）的合成前體[23]。同時類胡蘿卜素對人體具有很多益處，例如，抗氧化、延緩衰老、抗[24-26]。 類胡蘿卜素的合成類胡蘿卜素的合成是一系列復雜的酶促催化反應過程，目前其合成的分子
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本文編號：2882683