番茄(Solanum lycopersicum)是世界上栽培的重要蔬菜作物之一,同時(shí)也是研究花序及果實(shí)發(fā)育的重要模式植物,受到育種家們的廣泛關(guān)注。高等植物中花序結(jié)構(gòu),開花數(shù)目,果實(shí)大小及品質(zhì)和優(yōu)良的植物株型與產(chǎn)量直接相關(guān),對相關(guān)性狀調(diào)控基因的解析對于理解表型變異的遺傳基礎(chǔ),促進(jìn)優(yōu)良品種選育具有重要意義。番茄SINGLE-FLOWER TRUSS(SFT)基因是擬南芥開花相關(guān)基因FT的同源基因,該基因突變后直接影響花序結(jié)構(gòu)及開花數(shù)目,因此研究該基因相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)顯得尤為重要。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),番茄SPL13和COL1基因可以直接結(jié)合SFT基因的啟動子而調(diào)控其表達(dá),進(jìn)而影響番茄植株花序的發(fā)育及產(chǎn)量,本課題對兩個(gè)基因分別作了轉(zhuǎn)基因功能分析,并進(jìn)行了相關(guān)的分子遺傳及生物學(xué)分析。1.高等植物的花序和側(cè)枝都是由側(cè)生分生組織分化形成的,花序結(jié)構(gòu)對番茄果實(shí)產(chǎn)量有著直接的影響。前期本室已經(jīng)證實(shí)miR156a通過抑制SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN LIKE(SPL)轉(zhuǎn)錄因子家族基因的表達(dá),進(jìn)而調(diào)控番茄花序結(jié)構(gòu)和側(cè)生組織的發(fā)育。對其下游的7個(gè)SPL靶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),在番茄中抑制SPL13基因的表達(dá)可以導(dǎo)致營養(yǎng)花序增多,花及果實(shí)的數(shù)目減少,果實(shí)變小,果實(shí)產(chǎn)量降低等系列表型,這些表型與過量表達(dá)miR156a表型相似,說明SPL13基因可能是miR156a下游的主效靶標(biāo)基因。酵母單雜交、雙分子熒光素酶、GUS表達(dá)、EMSA及ChIP-QPCR等研究結(jié)果及SFT在轉(zhuǎn)基因材料中的遺傳表達(dá)分析表明,SPL13蛋白通過直接與花序相關(guān)基因SFT的啟動子結(jié)合而正向調(diào)控其表達(dá),從而控制花序的發(fā)育。此外,研究還發(fā)現(xiàn)SPL13負(fù)調(diào)控番茄側(cè)枝發(fā)育相關(guān)基因TEOSINTE BRANCHED1(TB1)和BARREN STALK1(BA1)的表達(dá),在番茄中過表達(dá)TB1和BA1基因可以顯著增加側(cè)枝的數(shù)目。同時(shí),免疫共沉淀(CoIP)試驗(yàn)驗(yàn)證了番茄側(cè)枝發(fā)育相關(guān)蛋白Lateral suppressor(Ls)可以直接與SPL13蛋白互作,并抑制其在體內(nèi)的活性,GUS表達(dá)試驗(yàn)進(jìn)一步證明了Ls可以通過影響SPL13-TB1/BA1途徑調(diào)控番茄的側(cè)枝發(fā)育。綜上所述,該研究結(jié)果為miR156a-SlSPLs調(diào)控番茄株型和產(chǎn)量的機(jī)制解析提供了依據(jù)。2.CONSTANS(CO)和CONSTANS-LIKE(COL)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控開花已在許多物種中被報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn),在番茄中過量表達(dá)CONSTANS-LIKE 1(COL1)基因會降低番茄花及果實(shí)的數(shù)目、果實(shí)變小;抑制該基因表達(dá)果實(shí)變大、產(chǎn)量升高。酵母單雜交及GUS表達(dá)試驗(yàn)結(jié)果顯示,與其他物種不同的是,番茄中的COL1可以不需要NFYB/NFYC的參與,通過直接結(jié)合啟動子區(qū)的CCAAT順式元件負(fù)調(diào)控SFT基因的表達(dá),進(jìn)而影響花序發(fā)育。同時(shí),研究發(fā)現(xiàn)COL1正調(diào)控果實(shí)和葉片中葉綠素的含量,過量表達(dá)COL1基因會導(dǎo)致番茄果實(shí)和葉片葉綠素含量升高,果實(shí)在綠熟期葉綠素積累較多,為墨綠色;紅熟期果實(shí)為深紅色,抗壞血酸含量顯著高于野生型;而抑制COL1基因的表達(dá)可以降低綠熟期果實(shí)葉綠素的含量,顏色變淺。Pull-down及免疫共沉淀(CoIP)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,COL1可以直接與GOLDEN2-LIKE(GLK2)蛋白相互作用,促進(jìn)GLK2的穩(wěn)定性,從而調(diào)控番茄果實(shí)色澤形成。
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S641.2
【部分圖文】：

圖 2-1 SPL13-RNAi和35S-miR156a轉(zhuǎn)基因植株表型相似（A）定植 10 周后來自有代表性轉(zhuǎn)基因番茄(左、中)和 WT(右)植株的第二個(gè)花序。（B）代表性轉(zhuǎn)基因（左、中）和 WT（右）番茄植株的單株總產(chǎn)量。所有轉(zhuǎn)基因株系均為 AilsaCraig 背景。（C-E） 花、果實(shí)的積累以及每株花序在三個(gè)發(fā)育階段的營養(yǎng)枝的百分比。（F）轉(zhuǎn)基因和 WT 番茄植株果實(shí)的縱橫徑的統(tǒng)計(jì)比較。（G,H）轉(zhuǎn)基因和 WT 番茄植株在種植后 8 周第一花序下的節(jié)間數(shù)。（I，J）來自轉(zhuǎn)基因或 WT 番茄植株的總果實(shí)產(chǎn)量和平均果實(shí)重量的值，選擇三個(gè)轉(zhuǎn)基因系的有代表性的四棵植株和四棵有代表性的 WT 植株中進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，利用 t 檢驗(yàn)對每組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異分為兩組：*P < 0.05，**P < 0.01。Figure 2-1 Transgenic SPL13-RNAi and 35S-miR156a tomato plants are phenotypically similar.(A) Second inflorescence from representative transgenic (left and middle) and WT (right) tomato plants at 10 weeks afterplanting. (B) Total fruit yield per plant for representative transgenic (left and middle) and WT (right) tomato plants. Alltransgenic lines arein the Ailsa Craig background. (C-E) Accumulation of flowers, fruits and the percentage ofvegetativebranches per inflorescences per plant at three developmental stages. (F) Statistical comparison of the vertical andhorizontaldiametersofthefruits fromthe transgenicandWTtomato plants. (G, H) Lateral branchingnumber and numberof nodes under the first inflorescence in the transgenic and WT tomato plants at seven or eight weeks after planting. (I, J)Mean values for the total fruit yield and f

圖 2-2 SPL13 CRISPR/Cas9轉(zhuǎn)基因株系的側(cè)枝及花序營養(yǎng)枝較野生型增加A）SPL13中設(shè)計(jì)的兩個(gè)sgRNA目標(biāo)位點(diǎn)（紅色箭頭）的示意圖。黑色箭頭表示用于PCR分析基因分型的引位置。（B）PCR擴(kuò)增三個(gè)CR-spl13轉(zhuǎn)基因T0代株系等位基因突變。Cas9基因的擴(kuò)增顯示轉(zhuǎn)基因植株為陽性C）通過DNA測序分析驗(yàn)證T0代CR-spl13等位基因的突變，在三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中發(fā)現(xiàn)，跨越兩個(gè)sgRNA靶位置都存在一個(gè)長片段的缺失，紅色字體表示sgRNA目標(biāo)序列，黑色方框表示PAM序列。（D，E）SPLRISPR/Cas9 T0代轉(zhuǎn)基因株系的側(cè)枝和花序營養(yǎng)枝增多的表型，紅色箭頭表示葉腋產(chǎn)生的側(cè)枝（D圖），花序營養(yǎng)枝（E圖），以WT（AC）作為對照。Figure 2-2 Increased vegetative branches from inflorescences and lateral branches in the SPL1CRISPR/Cas9 transgenic lines.A) Schematic illustration of the two sgRNA target sites (red arrows) designed in SPL13. Black arrows represent ocation of the primers that were used for PCR-based genotyping. (B) PCR-based analysis of three T0-generation Cpl13 mutant alleles with different amplicon lengths. Amplification of the Cas9 transgene is shown as a positive contC) Verification of the T0-generation CR-spl13 mutant alleles by DNA sequencing analysis. We found a long sequeeletion that spanned the two sgRNA target sites in all three lines. The red font indicates sgRNA target sequences. Tlack boxes indicate protospacer-adjacent motif (PAM) sequences. (D, E) Lateral branch and inflorescence vegetatranch phenotypes in the SPL13 CRISPR/Cas9 T0-generation lines. Red arrows indicate lateral branches

27圖 2-3 spl13突變體中側(cè)枝與果實(shí)數(shù)目觀察統(tǒng)計(jì)-spl13番茄植株中葉腋（由紅色箭頭表示）產(chǎn)生的側(cè)枝。（B）基于PCR擴(kuò)增的三個(gè)CR-spl13等位CR-spl13和WT番茄植株的側(cè)枝。（E，F(xiàn)）CR-spl13和WT番茄植株側(cè)枝和果實(shí)數(shù)目的統(tǒng)計(jì)分組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異分為兩組：*P < 0.05，**P < 0.01。e 2-3 Lateral branching and fruit number in the CR-spl13 lines without the PTXateral branching in the leaf axils (indicatedbyred arrows)in the CR-spl13 tomato plants. (B) PCR-baR-spl13 mutant alleles with different amplicon lengths. (C, D) Lateral branching in CR-spl13 and , F) Mean values for the lateral branching and total fruit number of the CR-spl13 and WT tomllysignificant differences between the mean values were evaluated using t-tests and are represented b, **P < 0.01.
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