中國甜柿自然脫澀性狀受顯性單基因控制,因而在完全甜柿遺傳改良中具有重大的應用價值,但其自然脫澀關鍵基因及其調控網絡尚不完全明確。已知中國甜柿自然脫澀過程與乙醛介導的“凝固效應”(即可溶性單寧向不溶性單寧的轉化過程)有關,但乙醛代謝下游的關鍵基因ALDH2(醛脫氫酶2基因家族)在其中的功能特性尚不清楚。本研究以中國甜柿(‘鄂柿1號’和‘羅田甜柿’),日本甜柿(‘陽豐’)和非完全甜柿(‘磨盤柿’)為試材,首先基于轉錄組數據庫中ALDH2基因相關差異表達片段,從‘鄂柿1號’(Diospyros kaki Thunb.‘Eshi 1’)中分離獲得了ALDH2基因家族成員的cDNA全長,分析其表達模式并利用柿葉片瞬時表達技術體系對ALDH2基因進行功能驗證;進而,應用酵母單雜交系統(tǒng)篩選與ALDH2基因互作的轉錄因子,進一步明確中國甜柿自然脫澀的分子調控網絡;最后,結合轉錄組測序技術和柿瞬時轉化體系,分析ALDH2及部分單寧代謝關鍵基因在中國甜柿葉片中瞬時超表達后的差異表達基因,進一步挖掘與中國甜柿自然脫澀直接相關的候選基因,以期為中國甜柿自然脫澀分子機理的解析及其遺傳改良提供科學依據。主要研究結果如下:1.基于轉錄組數據庫中的序列信息,通過cDNA末端快速擴增(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)技術獲得ALDH2基因家族兩個成員——DkALDH2a和DkALDH2b,其cDNA序列全長分別為1,984 bp和1,933 bp,分別編碼542和540個氨基酸。DkALDH2a和DkALDH2b在中國甜柿葉片中瞬時超表達后,葉片可溶性單寧和不溶性單寧含量均顯著升高;瞬時干涉表達后,葉片中可溶性單寧含量前者無明顯變化,后者顯著降低。二者均可通過減少可溶性單寧的消耗進而抑制脫澀。2.DkALDH2a主要作用于種子器官,其表達量在果實發(fā)育過程中逐漸降低,以致大量乙醛從種子擴散到果肉中,進而通過凝固效應促進脫澀。DkALDH2b主要是直接在果肉中大量表達,這可能是由于果肉中底物乙醛的積累所致,但其消耗的乙醛不足以阻止中國甜柿自然脫澀。因此,DkALDH2a和DkALDH2b的表達量與中國甜柿自然脫澀呈負相關關系。3.基于DkALDH2a和DkALDH2b全長序列信息,通過染色體步移技術分別分離到515 bp和1,209 bp啟動子序列。以DkALDH2b啟動子構建pALDH2b-AbAi誘餌載體并轉化Y1HGold酵母菌株,應用酵母單雜交技術從酵母文庫中篩選到16個陽性克隆,經序列分析后新發(fā)現1個與ALDH2b互作的BBR/BPC1轉錄因子。4.結合轉錄組測序技術和柿瞬時轉化體系,篩選ALDH2及單寧代謝關鍵基因LAC1和ANR在中國甜柿葉片中瞬時超表達后的特異表達基因,共得到119.63 Gb Clean Data。通過Trinity軟件從頭拼接(de novo assembly),共得到192,597個轉錄本、100,371條Unigene。其中56,009條Unigene(約55.8%)獲得了功能注釋信息。注釋為ERF家族的轉錄因子基因數目最高,且在三種處理中上調表達,說明其可能參與中國甜柿自然脫澀的調控過程。綜上所述,本研究明確了ALDH2基因家族的兩個成員——DkALDH2a和DkALDH2b與中國甜柿自然脫澀之間的關系,并發(fā)現可能調控中國甜柿自然脫澀的兩類轉錄因子BBR/BPC1和ERF。該結果為中國甜柿自然脫澀分子機理的解析及其遺傳改良提供了參考。
【學位單位】：華中農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S665.2
【部分圖文】：

6圖 1-1 柿單寧的生物合成途徑[根據 Akagi 等（2011）有修改]DAHPS：3-脫氧-D-阿拉伯糖型-庚酮糖酸-7-磷酸合成酶；DHQS：3-脫氫奎尼酸合成酶；DHD/SDH：3-脫氫奎尼酸脫氫酶/莽草酸-5-脫氫酶；SK：莽草酸激酶；EPSPS：5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶；CS：分支酸合酶；PAL：苯丙氨酸解氨酶；C4H：肉桂酸-4-羥化酶；4CL：4-香豆酸輔酶 A 連接酶；CHS：查爾酮合酶；CHI：查爾酮異構酶；F3H：黃烷酮-3-羥化酶；F3′H：類黃酮 3′-羥化酶；F3′5′H：類黃酮 3′5′-羥化酶；DFR：二氫黃酮醇-4-還原酶；ANS：花青素合酶；LAR：無色花青素還原酶；ANR：花青素還原酶；GT：糖基轉移酶；OMT：O-甲基轉移酶；GST：谷胱甘肽 S-轉移酶；MATE transporter：多藥物和有毒化合物排出轉運蛋白；CE：縮合酶。Fig. 1-1 The biosynthesis pathway of persimmon proanthocyanidinModified from Akagi et al.（2011）DAHPS: 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate synthase; DHQS: 3-dehydroquinate synthase;DHD/SDH: 3-dehydroquinate dehydratase/shikimate 5-dehydrogenase; SK: shikimate kinase; EPSPS:5-enolpyruvylshikimate 3-phosphte synthase; CS: chorismate synthase; PAL: phenylalanineammonia-lyase; C4H: cinnamate-4-hydroxylase; 4CL: 4-coumarate:CoA ligase; CHS: chalconesynthase; CHI: chalcone isomerase; F3H: flavanone 3-hydroxylase; F3′H: flavonoid 3′-hydroxylase;F3′5′H: flavonoid 3′5′-hydroxylase; DFR: dihydroflavonol 4-reductase; ANS: anthocyanidin synthase;LAR: leucoanthocyanidinreductase; ANR: anthocyanidin reductase; GT: glycosyltransferase; OMT:O-methyltransferase; GST: glutathione S-transferase; MATE transpo

kaki Thunb‘.Youhou’）和非完全甜柿‘磨盤柿’（D. kaki Thunb‘.Mopanshi’）2.5 WAB（花后數周）、5 WAB、10 WAB、15 WAB、20 WAB 和 25 WAB 的果實（圖2-1）。部分試材采用本課題組 Mo 等的研究材料（Mo et al. 2016）。取果實赤道部果肉，液氮速凍后于-80℃冰箱保存。三個品種盛花期的花、莖、葉以及 20 WAB 的萼片、果皮、果心和種子，每一份樣品進行 3 次生物學重復，每一個重復包括 10 個果實。

3 結果與分析3.1 不同脫澀類型柿果發(fā)育過程中單寧含量變化比較不同脫澀類型柿果中可溶性單寧百分含量隨著果實的發(fā)育均呈持續(xù)下降趨勢�！_田甜柿’果實在 25 WAB 時，可溶性單寧百分含量已降為 0.6%，此時已十分接近脫澀；‘陽豐’果實中可溶性單寧百分含量在發(fā)育前期便迅速下降，到 15 WAB時已經降至“澀感”臨界含量 0.1%以下，并一直保持極低水平，此時已完全脫澀，與先前人研究結果一致（Ikegami et al. 2005，Akagi et al. 2009）。‘磨盤柿’果實可溶性單寧百分含量一直要高于‘羅田甜柿’和‘陽豐’，直到 25 WAB 仍高于 1.0%，且有很強的澀感（圖 2-2a）。三類品種不溶性單寧的百分含量亦呈現下降趨勢，但與日本甜柿‘陽豐’和非完全甜柿‘磨盤柿’不同的是，中國甜柿‘羅田甜柿’果實發(fā)育 10-25 WAB 不溶性單寧含量呈現先上升后下降的變化過程（圖 2-2b）。
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本文編號：2879453