中國(guó)甜柿自然脫澀性狀受顯性單基因控制,因而在完全甜柿遺傳改良中具有重大的應(yīng)用價(jià)值,但其自然脫澀關(guān)鍵基因及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚不完全明確。已知中國(guó)甜柿自然脫澀過(guò)程與乙醛介導(dǎo)的“凝固效應(yīng)”(即可溶性單寧向不溶性單寧的轉(zhuǎn)化過(guò)程)有關(guān),但乙醛代謝下游的關(guān)鍵基因ALDH2(醛脫氫酶2基因家族)在其中的功能特性尚不清楚。本研究以中國(guó)甜柿(‘鄂柿1號(hào)’和‘羅田甜柿’),日本甜柿(‘陽(yáng)豐’)和非完全甜柿(‘磨盤(pán)柿’)為試材,首先基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中ALDH2基因相關(guān)差異表達(dá)片段,從‘鄂柿1號(hào)’(Diospyros kaki Thunb.‘Eshi 1’)中分離獲得了ALDH2基因家族成員的cDNA全長(zhǎng),分析其表達(dá)模式并利用柿葉片瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)體系對(duì)ALDH2基因進(jìn)行功能驗(yàn)證;進(jìn)而,應(yīng)用酵母單雜交系統(tǒng)篩選與ALDH2基因互作的轉(zhuǎn)錄因子,進(jìn)一步明確中國(guó)甜柿自然脫澀的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò);最后,結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)和柿瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系,分析ALDH2及部分單寧代謝關(guān)鍵基因在中國(guó)甜柿葉片中瞬時(shí)超表達(dá)后的差異表達(dá)基因,進(jìn)一步挖掘與中國(guó)甜柿自然脫澀直接相關(guān)的候選基因,以期為中國(guó)甜柿自然脫澀分子機(jī)理的解析及其遺傳改良提供科學(xué)依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:1.基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列信息,通過(guò)cDNA末端快速擴(kuò)增(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)技術(shù)獲得ALDH2基因家族兩個(gè)成員——DkALDH2a和DkALDH2b,其cDNA序列全長(zhǎng)分別為1,984 bp和1,933 bp,分別編碼542和540個(gè)氨基酸。DkALDH2a和DkALDH2b在中國(guó)甜柿葉片中瞬時(shí)超表達(dá)后,葉片可溶性單寧和不溶性單寧含量均顯著升高;瞬時(shí)干涉表達(dá)后,葉片中可溶性單寧含量前者無(wú)明顯變化,后者顯著降低。二者均可通過(guò)減少可溶性單寧的消耗進(jìn)而抑制脫澀。2.DkALDH2a主要作用于種子器官,其表達(dá)量在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中逐漸降低,以致大量乙醛從種子擴(kuò)散到果肉中,進(jìn)而通過(guò)凝固效應(yīng)促進(jìn)脫澀。DkALDH2b主要是直接在果肉中大量表達(dá),這可能是由于果肉中底物乙醛的積累所致,但其消耗的乙醛不足以阻止中國(guó)甜柿自然脫澀。因此,DkALDH2a和DkALDH2b的表達(dá)量與中國(guó)甜柿自然脫澀呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。3.基于DkALDH2a和DkALDH2b全長(zhǎng)序列信息,通過(guò)染色體步移技術(shù)分別分離到515 bp和1,209 bp啟動(dòng)子序列。以DkALDH2b啟動(dòng)子構(gòu)建pALDH2b-AbAi誘餌載體并轉(zhuǎn)化Y1HGold酵母菌株,應(yīng)用酵母單雜交技術(shù)從酵母文庫(kù)中篩選到16個(gè)陽(yáng)性克隆,經(jīng)序列分析后新發(fā)現(xiàn)1個(gè)與ALDH2b互作的BBR/BPC1轉(zhuǎn)錄因子。4.結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)和柿瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系,篩選ALDH2及單寧代謝關(guān)鍵基因LAC1和ANR在中國(guó)甜柿葉片中瞬時(shí)超表達(dá)后的特異表達(dá)基因,共得到119.63 Gb Clean Data。通過(guò)Trinity軟件從頭拼接(de novo assembly),共得到192,597個(gè)轉(zhuǎn)錄本、100,371條Unigene。其中56,009條Unigene(約55.8%)獲得了功能注釋信息。注釋為ERF家族的轉(zhuǎn)錄因子基因數(shù)目最高,且在三種處理中上調(diào)表達(dá),說(shuō)明其可能參與中國(guó)甜柿自然脫澀的調(diào)控過(guò)程。綜上所述,本研究明確了ALDH2基因家族的兩個(gè)成員——DkALDH2a和DkALDH2b與中國(guó)甜柿自然脫澀之間的關(guān)系,并發(fā)現(xiàn)可能調(diào)控中國(guó)甜柿自然脫澀的兩類轉(zhuǎn)錄因子BBR/BPC1和ERF。該結(jié)果為中國(guó)甜柿自然脫澀分子機(jī)理的解析及其遺傳改良提供了參考。
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S665.2
【部分圖文】：

6圖 1-1 柿單寧的生物合成途徑[根據(jù) Akagi 等（2011）有修改]DAHPS：3-脫氧-D-阿拉伯糖型-庚酮糖酸-7-磷酸合成酶；DHQS：3-脫氫奎尼酸合成酶；DHD/SDH：3-脫氫奎尼酸脫氫酶/莽草酸-5-脫氫酶；SK：莽草酸激酶；EPSPS：5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶；CS：分支酸合酶；PAL：苯丙氨酸解氨酶；C4H：肉桂酸-4-羥化酶；4CL：4-香豆酸輔酶 A 連接酶；CHS：查爾酮合酶；CHI：查爾酮異構(gòu)酶；F3H：黃烷酮-3-羥化酶；F3′H：類黃酮 3′-羥化酶；F3′5′H：類黃酮 3′5′-羥化酶；DFR：二氫黃酮醇-4-還原酶；ANS：花青素合酶；LAR：無(wú)色花青素還原酶；ANR：花青素還原酶；GT：糖基轉(zhuǎn)移酶；OMT：O-甲基轉(zhuǎn)移酶；GST：谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶；MATE transporter：多藥物和有毒化合物排出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；CE：縮合酶。Fig. 1-1 The biosynthesis pathway of persimmon proanthocyanidinModified from Akagi et al.（2011）DAHPS: 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate synthase; DHQS: 3-dehydroquinate synthase;DHD/SDH: 3-dehydroquinate dehydratase/shikimate 5-dehydrogenase; SK: shikimate kinase; EPSPS:5-enolpyruvylshikimate 3-phosphte synthase; CS: chorismate synthase; PAL: phenylalanineammonia-lyase; C4H: cinnamate-4-hydroxylase; 4CL: 4-coumarate:CoA ligase; CHS: chalconesynthase; CHI: chalcone isomerase; F3H: flavanone 3-hydroxylase; F3′H: flavonoid 3′-hydroxylase;F3′5′H: flavonoid 3′5′-hydroxylase; DFR: dihydroflavonol 4-reductase; ANS: anthocyanidin synthase;LAR: leucoanthocyanidinreductase; ANR: anthocyanidin reductase; GT: glycosyltransferase; OMT:O-methyltransferase; GST: glutathione S-transferase; MATE transpo

kaki Thunb‘.Youhou’）和非完全甜柿‘磨盤(pán)柿’（D. kaki Thunb‘.Mopanshi’）2.5 WAB（花后數(shù)周）、5 WAB、10 WAB、15 WAB、20 WAB 和 25 WAB 的果實(shí)（圖2-1）。部分試材采用本課題組 Mo 等的研究材料（Mo et al. 2016）。取果實(shí)赤道部果肉，液氮速凍后于-80℃冰箱保存。三個(gè)品種盛花期的花、莖、葉以及 20 WAB 的萼片、果皮、果心和種子，每一份樣品進(jìn)行 3 次生物學(xué)重復(fù)，每一個(gè)重復(fù)包括 10 個(gè)果實(shí)。

3 結(jié)果與分析3.1 不同脫澀類型柿果發(fā)育過(guò)程中單寧含量變化比較不同脫澀類型柿果中可溶性單寧百分含量隨著果實(shí)的發(fā)育均呈持續(xù)下降趨勢(shì)�！_田甜柿’果實(shí)在 25 WAB 時(shí)，可溶性單寧百分含量已降為 0.6%，此時(shí)已十分接近脫澀；‘陽(yáng)豐’果實(shí)中可溶性單寧百分含量在發(fā)育前期便迅速下降，到 15 WAB時(shí)已經(jīng)降至“澀感”臨界含量 0.1%以下，并一直保持極低水平，此時(shí)已完全脫澀，與先前人研究結(jié)果一致（Ikegami et al. 2005，Akagi et al. 2009）�！ケP(pán)柿’果實(shí)可溶性單寧百分含量一直要高于‘羅田甜柿’和‘陽(yáng)豐’，直到 25 WAB 仍高于 1.0%，且有很強(qiáng)的澀感（圖 2-2a）。三類品種不溶性單寧的百分含量亦呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但與日本甜柿‘陽(yáng)豐’和非完全甜柿‘磨盤(pán)柿’不同的是，中國(guó)甜柿‘羅田甜柿’果實(shí)發(fā)育 10-25 WAB 不溶性單寧含量呈現(xiàn)先上升后下降的變化過(guò)程（圖 2-2b）。
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本文編號(hào)：2879453