雄性不育廣泛存在于高等植物中,對于具有顯著雜種優(yōu)勢的十字花科蔬菜作物,雄性不育系的利用是配制雜交種的重要手段之一,因此,雄性不育性的研究一直受到育種專家的高度重視。由于自然突變的雄性不育材料較為稀少,利用人工誘變創(chuàng)制雄性不育材料,已經(jīng)成為雄性不育研究的重要手段。大白菜(Brassica campestris ssp.pekinensis)是十字花科蕓薹屬的重要作物,雜種優(yōu)勢十分顯著。本研究利用大白菜小孢子培養(yǎng)獲得的DH系‘FT’為試材,利用60Co-γ射線誘變與游離小孢子培養(yǎng)相結(jié)合的方法,創(chuàng)制出1份雄性不育突變體ftms;采用圖位克隆策略,并參考高通量測序結(jié)果,對突變基因ftms進行了鑒定,主要研究結(jié)果如下。1.大白菜雄性不育突變體ftms的表型特征和遺傳特性以突變體ftms為母本,與其野生型‘FT’雜交,配制F1和F2。遺傳分析結(jié)果表明,突變體ftms的雄性不育性由單隱性核基因控制。突變體ftms與野生型‘FT’在營養(yǎng)生長階段無明顯差異,在生殖生長階段突變體ftms花藥退化,無花粉。石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn),突變體ftms雄蕊敗育始于小孢子四分體時期,絨粘層細胞異常膨大且高度液泡化導致小孢子發(fā)生敗育。2.基于BSR-Seq的突變基因ftms初步定位以開白花的突變體ftms為母本,開黃花的白菜薹DH系‘14S701’為父本,構(gòu)建F2分離群體。F2群體中共有4種表型:黃花可育、黃花不育、白花可育及白花不育。遺傳分析結(jié)果表明,雄蕊育性與花瓣顏色2個性狀均由單隱性核基因控制,且為獨立遺傳。選取黃花可育與白花不育2種表型植株各50株,構(gòu)建2個RNA混池。通過BSR-Seq分析,同時定位了雄蕊育性和花瓣顏色2個基因,在A05和A02染色體上獲得了與目標性狀連鎖的候選區(qū)間。通過在候選區(qū)間內(nèi)進一步開發(fā)SSR連鎖標記進行驗證,將突變基因ftms定位于A05染色體,白花基因定位于A02染色體。3.基于F2大規(guī)模分離群體連鎖分析的突變基因ftms精細定位利用F2大規(guī)模分離群體中的2,600株雄性不育植株進一步縮小定位區(qū)間,最終將突變基因ftms定位于A05染色體的In Del20和In Del14標記之間,遺傳距離分別為0.02c M和0.06c M。經(jīng)與大白菜參考基因組(v1.5)比對,目標區(qū)間約1.7Mb,共有114個基因。由于定位區(qū)域位于A05著絲粒附近,造成重組困難,已無法進一步縮小定位區(qū)間。4.基于全基因組重測序的候選基因預測對突變體ftms及其野生型‘FT’進行了全基因組重測序,利用重測序信息對突變體ftms的突變位點進行了檢測。在定位區(qū)間內(nèi)突變體ftms上檢測到純合SNP和In Del突變位點82個,其中,在外顯子上只有1個錯義的SNP突變,所在基因編號為Bra010198,編碼β-(1,3)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶,其擬南芥同源基因AT1G33430參與花粉外壁形成。突變體ftms的Bra010198基因第5個外顯子上發(fā)生了G→T的堿基顛換,導致其蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域中281th氨基酸Gly(GGG)變?yōu)閂al(GTG)。q RT-PCR分析結(jié)果表明,候選基因Bra010198在雄蕊中特異性表達。5.候選基因Bra010198家族成員鑒定以擬南芥已鑒定出的20個β-(1,3)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶家族基因的蛋白序列為參考,在大白菜基因組中共篩選出30個β-(1,3)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶家族基因。大白菜β-(1,3)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶家族基因與其擬南芥同源基因具有較好的共線性關系。系統(tǒng)進化分析將大白菜β-(1,3)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶家族基因分為2個分支:group I和group II。理化性質(zhì)、保守motifs和外顯子/內(nèi)含子數(shù)目在各分支家族成員中相對一致。6.基于RNA-Seq的雄性不育突變體ftms轉(zhuǎn)錄組分析利用RNA-Seq技術(shù),對突變體ftms與野生型‘FT’的花蕾進行了比較轉(zhuǎn)錄組分析,共檢測到2,305個差異表達基因。與絨粘層發(fā)育相關的基因AMS、與胼胝質(zhì)合成相關的基因CALS5和CDKG1、與原外壁合成相關的基因RPG1、以及與花粉壁合成相關基因家族,包括3個AGPs、13個PLs、25個PMEs、7個PMEIs和18個PGs,在突變體ftms中均下調(diào)表達。經(jīng)GO和KEGG功能富集分析,發(fā)現(xiàn)與花粉及花粉管發(fā)育、細胞及花粉壁、糖類代謝和脂類代謝有關的GO terms被顯著富集。發(fā)現(xiàn)了7個與糖類代謝和脂類代謝有關的pathways被顯著富集。推測突變體ftms中β-(1,3)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因Bra010198的突變,通過影響AGPs的合成,進而導致絨粘層、胼胝質(zhì)、原外壁以及果膠代謝異常而造成雄蕊敗育。
【學位單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S634.1
【部分圖文】：

垂周分裂成外表皮層（epidermis）；L2 層細胞平周分裂ll），其經(jīng)過分裂向外產(chǎn)生初生周緣細胞（primary parietal （primary sporogenous cell）。L3 層細胞則分化成藥隔（stndle）。初生周緣細胞繼續(xù)分裂成次生周緣細胞（secondary一步分化形成由外向內(nèi)的藥室內(nèi)壁（endothecium）、中間層（。初生造孢細胞繼續(xù)分裂成次生造孢細胞（secondary sporo裂進一步分化形成小孢子母細胞（microspore mother cell）本建成，小孢子母細胞開始分化。第 6 期，小孢子母細胞細胞開始減數(shù)分裂。第 7 期，經(jīng)過減數(shù)分裂小孢子母細絨粘層分泌胼胝質(zhì)包裹。第 8 期，胼胝質(zhì)降解，釋放單孢子逐漸發(fā)育成成熟分花粉粒。第 10 期開始，絨粘層細ed Cell Death, PCD）。第 11 期，小孢子進行一次不對稱的養(yǎng)細胞，此時絨粘層細胞已經(jīng)降解為碎片和烏式體。第 1有絲分裂形成 2 個精細胞，形成含有 3 個核的成熟花粉粒 期，花藥藥隔開裂，釋放成熟花粉。第 14 期，花藥衰老

第一章 文獻綜述1.2.2 花藥及花粉發(fā)育相關基因目前，在花藥及花粉發(fā)育過程中大量與植物雄性不育的分子調(diào)控機制相關的基因已被揭示。以模式植物擬南芥為例，這些基因主要參與包括小孢子發(fā)生、絨粘層形成、胼胝質(zhì)層發(fā)育、花粉內(nèi)外壁形成及花粉開裂等各個環(huán)節(jié)（圖 1-2）。

從中篩選出 1 份雄蕊敗育徹底的雄性不育突變體，命名為 ftms（ FT male sterility，圖2-1）。以野生型 FT 為對照，采用流式細胞儀對雄性不育突變體 ftms 進行了倍性鑒定，結(jié)果表明雄性不育突變 ftms 為二倍體（圖 2-2）。用突變體 ftms 與野生型 FT 雜交，再自交分離出不育株后，用群體內(nèi)的不育株與可育株兄妹交，獲得了穩(wěn)定遺傳的雄性不育“兩用系”（ FTAB01 ），其不育株與可育株兄妹交后代 1:1 分離。本文中所用的雄性不育突變體 ftms，指的是 FTAB01 的不育株。2.2.2 雄性不育突變體 ftms 不育性的遺傳特性為了研究雄性不育突變體 ftms 的遺傳特性，將大白菜雄性不育突變體 ftms（P2）為母本，其野生型 FT （P1）為父本進行雜交
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