茶樹作為一種多年生葉用經(jīng)濟作物,充足的氮營養(yǎng)對其生長發(fā)育、生理生化代謝過程以及茶葉品質(zhì)的形成起著至關(guān)重要的作用。然而,茶樹對氮素的吸收利用能力有限,而且茶樹偏愛銨態(tài)氮(NH_4~+-N),對不同氮源的利用效率存在差異,因此一般的茶園管理中,為保證經(jīng)濟效益,氮肥過量施用的情況較為普遍,但這必然會造成資源浪費和環(huán)境污染。谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS;EC6.3.1.2)是高等植物氮素同化過程中最為關(guān)鍵的催化酶之一,與植物氮素吸收、同化和利用效率(Nitrogen use efficiency,NUE)緊密相關(guān),更重要的是,不同GS酶的基因成員在植物氮素吸收同化中功能不同。本研究以茶樹栽培種龍井43為研究對象,克隆了參與氮同化的獲得3個CsGS1基因的c DNA全長,對GS1s的表達產(chǎn)物的亞細胞定位和蛋白酶活性進行了研究,并研究了3個CsGS1基因在不同氮源中的表達模式和它們的組織特異性,以揭示其在茶樹氮代謝中的具體功能作用。主要研究結(jié)果如下:1.克隆了3個茶樹胞質(zhì)型谷氨酰胺合成酶基因CsGS1.1、CsGS1.2和CsGS1.3,生物信息學(xué)分析CsGS1s編碼的蛋白均具有GS家族的保守結(jié)構(gòu)域—Gln-synt__C,為親水性的位于細胞質(zhì)中的非分泌型蛋白質(zhì),沒有信號肽。通過Blast分析及進化樹構(gòu)建可知,茶樹CsGS1.1與葡萄GS1.1的親緣關(guān)系最近,茶樹CsGS1.2、CsGS1.3與毛白楊GS1的親緣關(guān)系最近;CsGS1.1s與擬南芥AtGln1;5、油菜BnGln1;5、大麥HvGS1;3、水稻OsGS1;3以及玉米ZmGS1;3表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系。2.將克隆的3個CsGS1s基因各自的編碼區(qū)分別與定位報告基因—綠色熒光蛋白GFP基因融合,對CsGS1s的表達產(chǎn)物進行精準的亞細胞定位。結(jié)果表明,CsGS1.1定位于細胞膜、質(zhì)和核中,CsGS1.2定位于細胞膜、質(zhì)中,CsGS1.3定位于細胞膜、質(zhì)中。3.分別對3個CsGS1s編碼區(qū)進行原核表達,純化得到各對應(yīng)的重組蛋白質(zhì)。SDS-PAGE電泳結(jié)果蛋白CsGS1s分別約為42、42和58 kD。分析各重組蛋白質(zhì)的谷氨酰胺合成酶催化特性顯示,3個重組CsGS1s蛋白均能催化谷氨酸和氨反應(yīng),生成谷氨酰胺。4.茶樹CsGS1s基因的表達存在時空特異性,即CsGS1.1/CsGS1.3基因在根部的相對表達量最高,CsGS1.2則主要在成熟葉中表達,但總體來看CsGS1.2在根莖葉中的相對表達豐度明顯低于CsGS1.1/CsGS1.3。分別對NH_4~+-N、NO_3~--N兩種培養(yǎng)條件下的3個CsGS1s的表達情況進行分析。在葉中,CsGS1.1的表達量在NO_3~-處理后期顯著提高,而CsGS1.2/CsGS1.3主要對NH_4~+處理有響應(yīng);在茶樹根中,CsGS1s的表達水平受NH_4~+-N的誘導(dǎo)顯著高于NO_3~--N,尤其是CsGS1.1/CsGS1.2。
【學(xué)位單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S571.1
【部分圖文】：

礦質(zhì)元素的變化。NH4+-N通過銨轉(zhuǎn)運蛋白（Ammonium transporters，AMT）進入植物體內(nèi)，被同化成有機態(tài)氮；而NO3--N則經(jīng)硝轉(zhuǎn)運蛋白（Nitrate transporter，NRT）的介導(dǎo)進入植物體經(jīng)過硝酸還原酶（Nitrate reductase，NR）、亞硝酸還原酶（Nitrite reductase，NiR）還原為NH（伍炳華等，1994），才能進一步被同化成為植物自身可用的有機態(tài)氮（Maeda et al.，2014近年來隨著研究的不斷深入，研究者們發(fā)現(xiàn)參與氮素吸收和轉(zhuǎn)運的不僅僅有AMT和NRT基因他一些基因也參與氮素的轉(zhuǎn)運和吸收，從而共同完成氮吸收利用。Swarbreck等（2011）發(fā)現(xiàn)谷酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）在氮素吸收、轉(zhuǎn)運和分配過程中起著重要作用。NH4+或NO3-通過根細胞膜上的轉(zhuǎn)運蛋白吸收進入植株后，大部分NH4+在細胞基質(zhì)中代謝分NO3-在細胞質(zhì)中代謝而部分則經(jīng)主動運輸?shù)竭_葉片。氮素被植物吸收后，氮素被同化成植物以利用的有機態(tài)氮。一般認為植物體內(nèi)氮同化有2個途徑，一個是NH4+-N與α-酮戊二酸在谷氨脫氫酶（Glutamate dehydrogenase，GDH）的作用下生成谷氨酸，另一個是NH4+-N經(jīng)過谷氨酰合成酶（Glutamine synthetase，GS）/谷氨酸合成酶（Glutamate synthetase,GOGAT）循環(huán)途徑成谷氨酰胺（莫良玉等，2001；李維等，2015）。但是GDH對NH3的親和性較低，一般認為它要在解除氨毒中其主要作用（李常健等，2000），而GS/GOGAT途徑才是植物中氮同化的主要徑（圖1.1），而且谷氨酰胺合成酶（GS）是氮同化的關(guān)鍵酶，是一種限速酶，起到氨庫的作，也是將無機氮轉(zhuǎn)化成有機氮的重要門戶（Lea & Mifliu，1974）。

+才能參與GS/GOGAT循環(huán)過程（圖1.2）。目前已報道的參與茶樹氮素吸收利用的蛋白和主要基因詳見表1.1。圖 1.2 茶樹氮素吸收利用過程簡圖Fig.1.2 Overview of nitrogen utilization and assimilation in tea plant

完整的未被降解的RNA是克隆基因全長的重要前提，本試驗提取茶樹‘龍井43’葉片的總RNA的OD值260/280基本在1.8-2.0之間，表明RNA純度可以滿足實驗需要。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA純度，電泳結(jié)果如圖2.1，結(jié)果顯示RNA條帶清晰，說明所獲得的RNA完整性良好，可以進行后續(xù)試驗。
【參考文獻】

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本文編號：2878763