發(fā)布時間：2020-11-10 14:34

　　 褶紋冠蚌(Cristaria plicata)軟體動物門,蚌科,我國常見育珠蚌之一,易被感染引發(fā)疾病,增加養(yǎng)殖行業(yè)風險,因而,進行貝類分子免疫方面的研究意義重大。本文運用巢氏PCR和RACE PCR克隆得到了褶紋冠蚌Mu型和Theta型谷胱甘肽硫轉移酶基因的cDNA全長。CpGST3基因的cDNA全長為1026 bp,其中包含了558 bp的開放閱讀框,編碼185個氨基酸,5’端非編碼區(qū)71 bp,3’端非編碼區(qū)397 bp。預測蛋白分子量是21.7 kDa,等電點是5.38。CpGST4基因cDNA全長是1301 bp,其中包含了759 bp的開放閱讀框,編碼252個氨基酸,5’端非編碼區(qū)185 bp;3’端非編碼區(qū)357 bp。預測蛋白分子量為29.30 kDa,等電點為6.17。通過對CpGST3、CpGST4基因在蚌的五種組織中表達情況分析發(fā)現,CpGST3、CpGST4基因在鰓組織、肝胰腺、閉殼肌、外套膜、血淋巴中均有表達,CpGST3基因表達量最高的組織是肝胰腺,鰓中最低,CpGST4基因表達量最高的組織也是在肝胰腺中,但外套膜最低。并研究了微囊藻毒素刺激褶紋冠蚌后,CpGST3和CpGST4在血淋巴和肝胰腺中表達量的變化,結果顯示:微囊藻毒素刺激蚌后,蚌血細胞和肝胰腺的CpGST3基因表達量開始上升,分別在24 h、12 h達到最高,隨后逐步降低,CpGST4基因表達量也是逐步上升,表達量在12 h都達到了最高,隨后逐步下降。將CpGST3、CpGST4基因的開放閱讀框和PET-32a質粒經BamH1、HindIII雙酶切之后,成功構建了PET-32a-CpGST3、PET-32a-CpGST4原核表達質粒。然后將重組質粒轉入到BL21中,經IPTG,誘導8 h后,得到了融和蛋白,電泳檢測顯示重組蛋白均是以包涵體形式存在,用純化柱進行純化,分別得到濃度為0.4676 mg/mL的CpGST3融合蛋白和0.312 mg/mL的CpGST4融合蛋白。
【學位單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S917.4
【部分圖文】：

SMART技術原理圖（引用自Clontech）

褶紋冠蚌總RNA提取圖

第 2 章 褶紋冠蚌谷胱甘肽硫轉移酶基因的克隆與表達分析2.3.2 褶紋冠蚌 CpGST3、CpGST4 基因 cDNA 全長克隆經過 3’和 5’RACE 擴增，得到了 498 bp 和 523 bp 的序列。以 CpGST4 基因的中間片段為基礎，通過 5’和 3’RACE 擴增分別得到 662 bp 序列和 579bp 序列（如圖 2.4）。使用 DNAMAN 軟件將中間片段、3’和 5’末端序列進行拼接，獲得了 CpGST3、CpGST4 基因 cDNA 全長。
【參考文獻】

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本文編號：2878045