第一部分NAT2基因多態(tài)性與AML遺傳易感性研究背景:急性髓系白血病(acutemyelocytic leukemia,AML)是成年人中最好發(fā)的一類白血病,也是一種起源于造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病。隨著研究的廣泛開展和深入進(jìn)行,我們對(duì)于AML的發(fā)病機(jī)制有了越來越多的了解和認(rèn)識(shí)。遺傳-環(huán)境模式依然是當(dāng)前對(duì)于AML發(fā)病原因最主流的認(rèn)識(shí)。在遺傳因素的研究中,一些重要基因突變與AML發(fā)病之間的關(guān)聯(lián)性被不斷揭示。2型N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(N-acetyltransferase2,NAT2)是乙酰轉(zhuǎn)移酶家族中的一員,在人體對(duì)于外來性化合物的代謝過程中發(fā)揮著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)在編碼NAT2的基因上存在著較多的單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms,SNPs)。進(jìn)一步的研究顯示,某些可以影響NAT2催化效率的SNPs與多種腫瘤的遺傳易感性相關(guān),rs1799930(G590A)和rs1799931 (G857A)就是其中比較突出的兩個(gè)。近年國外進(jìn)行的一些研究顯示,這兩個(gè)SNPs與白血病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)存在著相關(guān)性,但是在我國人群,尤其是漢族人群中是否具有這種相關(guān)性還沒有報(bào)道。因此,我們進(jìn)行了這項(xiàng)病例對(duì)照研究來探討在我國漢族人群中NAT2的這兩個(gè)SNPs與AML的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是否具有明確的相關(guān)性。方法與結(jié)果:1、我們收集了 98例我院初診的AML患者和112例健康體檢者的外周血標(biāo)本,在提取全血DNA后,再通過PCR擴(kuò)增,最后通過對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序得到了病例組和對(duì)照組在rs1799930和rs1799931這兩個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因型數(shù)據(jù)。病例組中rs1799930位點(diǎn)共有基因型GG 59例、GA 31例、AA 8例,rs1799931位點(diǎn)共有基因型GG 68例、GA28例、AA 2例;對(duì)照組中rs1799930位點(diǎn)共有基因型GG 61例、GA 46例、AA 5例,rs1799931位點(diǎn)共有基因型GG61例、GA46例、AA5例。2、我們通過數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)SNPs數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步的分析。通過卡方檢驗(yàn),確定了病例組和對(duì)照組均滿足哈迪溫伯格平衡定律(P0.05)。進(jìn)一步的分析顯示,NAT2基因的rs1799930 SNPs與AML的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)沒有顯著相關(guān)性(P0.05); NAT2基因的rs1799931 SNPs與AML的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān),rs1799931的突變等位基因A是AML發(fā)病的一個(gè)保護(hù)因素(OR=0.585, 95%CI=0.361-0.950),雜合子GA基因的攜帶者比祖先基因型GG的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)要低(OR=0.546, 95%CI=0.305-0.978)。結(jié)論:在我國漢族人群中,NAT2基因的rs1799930 SNPs與AML的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)沒有顯著相關(guān)性,rs1799931 SNPs與AML的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。rs1799931的突變等位基因A是AML發(fā)病的一個(gè)保護(hù)因素,雜合子GA基因的攜帶者比祖先基因型GG的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)要低。第二部分NPC1與經(jīng)典wnt信號(hào)通路的相互作用及機(jī)制研究背景:Wnt信號(hào)通路是調(diào)控多細(xì)胞生物生長發(fā)育以及維持機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的一條重要信號(hào)通路。經(jīng)典的wnt/β-catenin信號(hào)通路是目前wnt信號(hào)通路中研究最廣泛也最透徹的一條信號(hào)。經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的異常與腫瘤、退行性疾病等多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。諸多的研究已經(jīng)證明,經(jīng)典wnt信號(hào)通路與正常和異常的造血均有緊密的聯(lián)系。通過靶向抑制經(jīng)典wnt信號(hào)通路已經(jīng)成為了包括治療白血病在內(nèi)的多種腫瘤的一個(gè)研究熱點(diǎn)。C型1類尼曼匹克蛋白(Niemann-Pick disease type C1 ,NPC1)是存在于溶酶體/晚期內(nèi)體膜上的一個(gè)重要蛋白,與細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇和某些鞘磷脂等脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)緊密相關(guān)。NPC1或者NPC2基因的突變可以導(dǎo)致C型尼曼匹克病的發(fā)生。先前的研究顯示,NPC1突變的細(xì)胞內(nèi)存在著多個(gè)信號(hào)通路的異常,wnt信號(hào)通路也有可能置身其中。還有研究顯示,經(jīng)典wnt信號(hào)通路可以調(diào)控細(xì)胞內(nèi)膽固醇的代謝,作為膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)環(huán)節(jié)中必不可少的重要蛋白,NPC1也有可能受到經(jīng)典wnt信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。但是目前還沒有關(guān)于NPC1與經(jīng)典wnt信號(hào)通路之間相互作用的確切報(bào)道。因此,我們進(jìn)行了本項(xiàng)研究來探究NPC1與經(jīng)典wnt信號(hào)通路之間的確切作用關(guān)系和相關(guān)機(jī)制。方法與結(jié)果:1、我們?cè)诔Ｒ姷膸讉�(gè)細(xì)胞系中使用慢病毒的方法,構(gòu)建了 NPC1穩(wěn)定敲低的細(xì)胞系。通過蛋白印跡(westernblotting,WB)檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白表達(dá)量的變化。接著我們通過WB技術(shù)和免疫熒光技術(shù)(immunofluorescent staining,IF)檢測(cè)了β-catenin蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布。我們還使用了定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative polymerase chain reaction,QPCR)技術(shù)和Top-Flash報(bào)告基因技術(shù)檢測(cè)了經(jīng)典wnt信號(hào)通路下游靶基因的轉(zhuǎn)錄水平變化,明確wnt信號(hào)通路活性的變化。最后我們通過在NPC1敲低細(xì)胞系中過表達(dá)NPC1,檢測(cè)β-catenin蛋白量的變化,確定是否能夠回救NPC1敲低對(duì)經(jīng)典wnt信號(hào)通路的抑制作用。結(jié)果顯示,NPC1敲低或者功能受抑后細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白的總量減少,細(xì)胞核內(nèi)的β-catenin減少,wnt信號(hào)通路下游靶基因轉(zhuǎn)錄水平下降,過表達(dá)NPC1后,NPC1敲低細(xì)胞中下調(diào)的β-catenin蛋白恢復(fù)正常水平。2、我們通過使用放線菌酮(cycloheximide,CHX)阻斷細(xì)胞內(nèi)β-catenin合成之后,使用WB技術(shù)檢測(cè)不同組細(xì)胞內(nèi)β-catenin隨時(shí)間的變化。通過免疫沉淀技術(shù)(immunoprecipitation,IP)和WB,檢測(cè)不同組細(xì)胞內(nèi)β-catenin的泛素化水平差異。結(jié)果顯示,NPC1敲低或者功能受抑后,細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白的下降速率更快、泛素化水平更高。3、我們通過慢病毒技術(shù)構(gòu)建了 β-catenin穩(wěn)定敲低的細(xì)胞系,通過WB檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NPC1表達(dá)的變化,使用QPCR檢測(cè)了NPC1轉(zhuǎn)錄水平的變化。我們還使用了 wnt信號(hào)通路的激動(dòng)劑和抑制劑來干預(yù)wnt信號(hào)通路活性,WB檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NPC1表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示敲低β-catenin或者使用經(jīng)典wnt信號(hào)通路抑制劑之后NPC1的表達(dá)水平降低。過表達(dá)β-catenin或者使用經(jīng)典wnt信號(hào)通路的激動(dòng)劑可以上調(diào)NPC1的表達(dá)。4、我們?cè)贙562細(xì)胞系中通過敲低NPC1以及使用NPC1的抑制劑后,使用細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒來檢測(cè)細(xì)胞增殖受到的影響。結(jié)果顯示,在敲低NPC1或者使用NPC1抑制劑之后,細(xì)胞的增殖顯著受抑。在K562耐藥細(xì)胞細(xì)胞株中聯(lián)合使用NPC1抑制劑和伊馬替尼之后,細(xì)胞增殖相比單獨(dú)使用伊馬替尼的細(xì)胞明顯受抑。結(jié)論:NPC1可以通過影響β-catenin的磷酸化-泛素化-蛋白酶體降解,調(diào)控經(jīng)典wnt信號(hào)通路的活性。經(jīng)典wnt信號(hào)通路也可以調(diào)控NPC1的表達(dá)。NPC1與經(jīng)典wnt信號(hào)通路之間存在相互調(diào)節(jié)的關(guān)系。我們可以通過使用NPC1的抑制劑來抑制經(jīng)典wnt信號(hào)通路的活性,從而使白血病細(xì)胞(至少依賴于經(jīng)典wnt信號(hào)通路的白血病細(xì)胞)生長受抑,甚至使因?yàn)榻?jīng)典wnt信號(hào)通路過度活化導(dǎo)致耐藥的白血病細(xì)胞重新獲敏。
【學(xué)位單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R733.71
【部分圖文】：

帶有shRNA插入序

?Ｉ??圖２?ＱＰＣＲ反應(yīng)的程序設(shè)置??兩步法ＰＣＲ擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序（圖２）：??第一步：預(yù)變性，??９５°Ｃ，３０?秒。??第二步：ＰＣＲ反應(yīng)，??９５°Ｃ?５秒，６０°Ｃ?３０－６０秒，如此循環(huán)４０次。??第三步：分罔。??（５）實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析??１）

４．３．２ＮＰＣ１的功能被抑制劑抑制之后，細(xì)胞內(nèi)的ｐ－ｃａｔｅｕｉｎ總量減少??Ｕ１８６６６Ａ?（本文中亦簡(jiǎn)稱作ＵＡ），可以抑制ＮＰＣ１的功能，研宄中常用它來模擬??敲低ＮＰＣ１的狀態(tài)，被認(rèn)為是ＮＰＣ１的經(jīng)典抑制劑。文獻(xiàn)中幾乎還沒有用ＵＡ來處理??Ｈｅｌａ細(xì)胞的報(bào)道。經(jīng)過我們的摸索，發(fā)現(xiàn)在Ｈｅｌａ細(xì)胞中，當(dāng)ＵＡ的濃度大于等于２Ｕｇ／ｍｌ??的時(shí)候，細(xì)胞內(nèi)的Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ總量會(huì)有比較明顯的下降。對(duì)于ＵＡ，這樣的使用濃度與??文獻(xiàn)報(bào)道中其他細(xì)胞的常用濃度處于ｕｇ／ｍｌ這同一量級(jí)。ＵＡ對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ總量??的抑制作用呈現(xiàn)出濃度依賴的關(guān)系（圖４）。但是ＵＡ的濃度也不是可以無限制的增加，??一方面受限于在溶劑中的溶解性，當(dāng)濃度過大時(shí)，有細(xì)胞毒性的溶劑（ＤＭＳＯ）將會(huì)??嚴(yán)重影響細(xì)胞狀態(tài)；另一方面，ＵＡ自身也存在著較大的細(xì)胞毒性，濃度過大時(shí)將導(dǎo)??致細(xì)胞闊亡。??Ｈｅｌａ??ＵＡ?（ｕｇ／ｍｌ），?１?２ｈ?０?２?３?４?５??
【參考文獻(xiàn)】

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1 Roel NUSSE;Wnt signaling in disease and in development[J];Cell Research;2005年01期

本文編號(hào)：2875643