蟲草是寄生于昆蟲、植物和少數(shù)真菌的一類真菌的總稱,是真菌遺傳學(xué)研究的好材料,其中許多種類屬于名貴藥材。雪峰蟲草(Ophiocordyceps xuefengensis)為近年來發(fā)現(xiàn)的真菌新物種,它寄生于活體植物大青的根或者莖中的癤蝙蛾幼蟲體上,僅在湖南雪峰山區(qū)有發(fā)現(xiàn),是已知的最大的蟲草,被證實是與冬蟲夏草(O.sinensis)親緣關(guān)系最近的物種。本論文對雪峰蟲草無性型的生物學(xué)特性、人工培養(yǎng)條件、有效成分和交配型基因進(jìn)行了研究。(1)從野生雪峰蟲草子座中分離獲得菌株,從分離菌的培養(yǎng)特性、形態(tài)特征、分子水平(ITS區(qū)序列)等方面展開研究,并對分離菌進(jìn)行人工培育,獲得了雪峰蟲草的子座,從而確定了雪峰蟲草的無性型;交配型基因的分布檢測結(jié)果表明:只有子囊含有兩種交配型基因,證明雪峰蟲草屬于異宗配合真菌。(2)以雪峰蟲草菌作為出發(fā)菌株,在單因素實驗的基礎(chǔ)上,采用PB實驗設(shè)計、最陡爬坡實驗和中心組合實驗優(yōu)化發(fā)酵條件,并通過建立多項式數(shù)學(xué)模型,采用統(tǒng)計分析對模型進(jìn)行顯著性檢驗擬合出最佳發(fā)酵條件。在優(yōu)化的條件下,發(fā)酵液中菌絲的生物量可達(dá)18.8 g/L,相比單因素實驗最適條件下菌絲的生物量16 g/L,提高了 17.5%。通過L9(34)正交試驗確定了雪峰蟲草子座的最佳培養(yǎng)條件為:固體基質(zhì)20 g、固體基質(zhì)與子實體培養(yǎng)液比為1:2(W/V)、接種量為3%、22℃培養(yǎng)15 d(黑暗條件下),將組培瓶置于光照強(qiáng)度為20～40 Lux,溫度為19℃,培養(yǎng)60 d后,子座干重達(dá)4.78 g,轉(zhuǎn)化率可達(dá)22%。這為進(jìn)一步研究雪峰蟲草的活性物質(zhì)打下了堅實的基礎(chǔ)。(3)對雪峰蟲草不同組織的主要活性成分進(jìn)行了分析。采用高效液相色譜法(HPLC)系統(tǒng)分析了雪峰蟲草不同組織中9種主要核苷類成分的含量,結(jié)果表明野生子實體中含腺苷最高(761.5 mg/kg),其次是人工培育的子座(721.2 mg/kg)和發(fā)酵菌絲體(623.9 mg/kg);發(fā)酵菌絲體中尿嘧啶、腺嘌呤、尿苷和鳥苷的含量顯著高于野生雪峰蟲草樣品;人工培育雪峰蟲草中鳥苷的濃度也高于野生樣品。人工培育的子座中腺苷的含量達(dá)到0.06%以上,遠(yuǎn)高于中國藥典(2015版)規(guī)定天然蟲草中腺苷的含量(0.01%)。雪峰蟲草的3種不同組織(菌核、子座和菌絲體)中蟲草酸含量分別為7.8%、11.7%和15.0%;其不飽和脂肪酸的相對含量分別是77.6%、66.1%和65.4%,菌核中的脂肪酸主要為油酸(單不飽和脂肪酸),人工子座和發(fā)酵菌絲體中脂肪酸主要為亞油酸(多不飽和脂肪酸)。3種不同組織中氨基酸含量分別為211.55 mg/g、191.48 mg/g和282.26 mg/g;人體必需8種氨基酸含量分別為104.93 mg/g、60.79mg/g和108.49mg/g。從核苷、蟲草酸、脂肪酸和氨基酸水平來分析,雪峰蟲草的發(fā)酵菌絲體和人工培育的子座可作為野生雪峰蟲草的代品。(4)對雪峰蟲草交配型MAT1-1和MAT1-2基因座進(jìn)行了克隆與分析。利用hiTAIL-PCR技術(shù)克隆了雪峰蟲草交配型MAT1-1和MAT1-2基因位點全長序列,并通過Southern印跡雜交技術(shù)對hiTAIL-PCR克隆的交配型MAT1-1和MAT1-2基因位點中的基因進(jìn)行檢測和驗證。結(jié)果表明:①雪峰蟲草與已報道的冬蟲夏草的交配型基因MAT1-1位點和MAT1-2位點內(nèi)基因的構(gòu)成方式相同。②雪峰蟲草的MAT1-2位點上含有單個基因MAT1-2-1,且為單拷貝基因。③MAT1-1位點包含MAT1-1-3、MAT1-1-2和MAT1-1-1三個基因,且極可能為單拷貝位點。④交配型MAT1-1和MAT1-2位點的左側(cè)共有序列上含有DNA lyase基因。⑤雪峰蟲草MAT1-1-3基因編碼區(qū)長728 bp,含3個內(nèi)含子,編碼的多肽為192個氨基酸。MAT1-1-2基因編碼區(qū)長1318bp,含3個內(nèi)含子,編碼的多肽為382個氨基酸;MAT1-1-1基因編碼區(qū)長1220 bp,含2個內(nèi)含子,編碼的多肽為371個氨基酸。MAT1-2位點僅包含MAT1-2-1基因,其編碼區(qū)長855bp,有2個內(nèi)含子,編碼249個氨基酸。雪峰蟲草交配型基因座中MAT1-1-3、M4T1-1-2、MAT1-1-1和MAT1-2-1編碼的氨基酸序列與冬蟲夏草的相應(yīng)氨基酸序列相似性分別為89%、88%、84%和90%,是目前已知的與冬蟲夏草在DNA水平上相似性最高的物種。本研究為雪峰蟲草的人工培養(yǎng)提供了理論指導(dǎo);雪峰蟲草的交配型體系為研究有性繁殖和性別選擇提供了新的模型,為更好地了解真菌的遺傳提供了線索。
【學(xué)位單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：Q949.32
【部分圖文】：

２－１、Ａ：雪峰蟲草；Ｂ－Ｅ：分離菌株在ＰＤＡ上的菌落形態(tài)（Ｂ，３ｄ；?Ｃ，１０ｄ；?Ｄ，１５ｄ；?Ｅ，４５ｄ）??Ｆ：分離菌株的“Ｈ”型菌絲結(jié)合（４０〇ｘ）；?Ｇ：分離菌株的菌絲和分生孢子（４０〇ｘ）；標(biāo)尺＝１〇叫１??Ｆｉｇ．?２－１?Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，?ｃｏｌｏｎｉｅｓ?ａｎｄ?ｃｏｎｉｄｉｏｓｐｏｒｅｓ?ｏｆ?Ｏｐｈｉｏｃｏｒｄｙｃｅｐｓ?ｘｕｅｆｅｎｇｅｎｓｉｓ??Ａ：?Ｏｐｈｉｏｃｏｒｄｙｃｅｐｓ?ｘｕｅｆｅｎｇｅｎｓｉｓ＼?Ｂ－?Ｅ?Ｃｏｌｏｎｙ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｓｔｒａｉｎ?ｏｎ?ＰＡＤ?ｍｅｄｉｕｍ?（Ｂ，?３ｄ；?Ｃ，?ｌＯｄ；?Ｄ，?１５ｄ；?Ｅ，??４５ｄ）?Ｆ：?Ｈｙｐｈａｌ?ｆｕｓｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｓｔｒａｉｎ；?Ｇ：?Ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈ?ｏｆ?ｍｙｃｅｌｉｕｍ?ａｎｄ?ｃｏｎｉｄｉｏｓｐｏｒｅｓ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｓｔｒａｉｎ?（４００?ｘ）；??Ｂａｒｓ＝１０｝ｉｍ??分離的雪峰蟲草菌株在改良的ＰＤＡ固體培養(yǎng)基上生長緩慢，２５°Ｃ下培養(yǎng)４５?ｄ菌落??直徑為４．７？５．３?ｃｍ。菌落圓形，粉末樣，致密，２５°Ｃ下培養(yǎng)３ｄ左右即在組織塊上長出??白色的菌絲（圖２－１Ｂ），?５ｄ后菌絲體延伸到固體培養(yǎng)基表面；１０ｄ后菌落直徑達(dá)到１．６??

?１??０．０２??圖２－２?ＮＪ法構(gòu)建的基于ＩＴＳ序列的雪峰蟲草和其它線蟲草的系統(tǒng)發(fā)育樹??Ｆｉｇ．?２－２?Ｔｈｅ?ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ?ｄｅｎｄｒｏｇｒａｍ?ｏｆ?Ｏｐｈｉｏｃｏｒｄｙｃｅｐｓ?ｘｕｅｆｅｎｇｅｎｓｉｓ?ａｎｄ?ｏｔｈｅｒ?Ｏｐｈｉｏｃｏｒｄｙｃｅｐｓ?ｓｐ．??ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ?ｂｙ?ｕｓｉｎｇ?ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ?（ＮＪ）?ｍｅｔｈｏｄ?ｂａｓｅｄ?ｏｎ?ｔｈｅ?ＩＴＳ?ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ??２．?３．?１．?３交配型基因在雪峰蟲草中的分布??雪峰蟲草是近年來新發(fā)現(xiàn)的真菌物種，同屬不同種的交配型基因的序列相似性較??低，其完整序列的擴(kuò)增相對較復(fù)雜，目前常通過ＰＣＲ技術(shù)擴(kuò)增Ｍ４７７－ｉ－７基因中的高保??守ａ－ｂｏｘ片段和Ｍ４７７－２－７基因中的高保守ＨＭＧ－ｂｏｘ片段，以此來快速鑒別蟲草的??型和從４７７－２型［８２，９８］。交配型檢測結(jié)果如圖２－３所示，結(jié)果表明：特異性引物??ＭＡＴ１－１Ｆ１／ＭＡＴ１－１Ｒ２?和?ＭＡＴ１－２Ｆ１／ＭＡＴ１－２Ｒ２?分別從野生的雪峰蟲草（ＭＨＨＮＵ８７２８、??ＭＨＨＮＵ８９９１、ＭＨＨＮＵ８９９２和ＭＨＨＮＵ８９９３）成熟子囊的基因組ＤＮＡ中擴(kuò)增出約??為２００?ｂｐ和３４０?ｂｐ的特異性條帶

ｖ??Ａ??圖２－４交配型基因在成熟的雪峰蟲草中的分布示意圖（該圖由田徑根據(jù)模式標(biāo)本手繪??Ａ：成熟的雪峰蟲草；Ｂ：子座上的有性子囊；Ｃ：子囊結(jié)構(gòu)??Ｆｉｇ．?２－４?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｍａｔｉｎｇ?ｇｅｎｅ?ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ?ｉｎ?ｍａｔｕｒｅ?ａｓｃｏｍａｔａ?ｏｆ?Ｏ．?ｘｕｅｆｅｎｇｅｎｓｉｓ?（Ｄｒａｗ??ｂｙ?Ｊｉｎｇ?Ｔｉａｎ?ｆｒｏｍ?ｔｈｅ?ｈｏｔｏｔｙｐｅ?ＭＨＨＮＵ７９６６?ａｎｄ?ＧＺＵＨ２０１２ＨＮ１９）．??Ａ：?Ｔｈｅ?ｍａｔｕｒｅ?Ｏ．?ｘｕｅｆｅｎｇｅｎｓｉｓ：?Ｂ：?Ｂｒｏｗｎ，?ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ?ａｓｃｏｍａｔａ?ｏｎ?ｓｔｒｏｍａｔａ；?Ｃ：?Ｓｅｔｉｏｎ?ｏｆ?ａｓｃｏｍａｔａ．??２．?３．?２雪峰蟲草菌株子座的培養(yǎng)??將分離出的雪峰蟲草接種于子實體培養(yǎng)基上，２個月后于子實體培養(yǎng)基上長出了粗??壯的子座（圖２－５）。子座圓柱形，直徑為１－６?ｍｍ，長度可達(dá)１３０?ｍｍ，生長末端為米色，??生長過程中子座外壁逐漸轉(zhuǎn)變成黃褐色，內(nèi)部呈米色，質(zhì)地堅硬，與天然雪峰蟲草子座??２１??
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本文編號：2876057