發(fā)布時間：2020-11-08 20:11

　　 黃酮類化合物是一類廣泛存在于植物中的次生代謝產(chǎn)物,對于植物的自身防御和生理調(diào)節(jié)具有重要的作用。黃酮類化合物還具有抗氧化、抑菌消炎、抑制腫瘤細胞活性、抗HIV活性等功能,且毒性較小,藥用價值較高。種子植物中黃酮代謝途徑已研究的較為清楚。蕨類是一類黃酮含量較高的植物類群,但其黃酮代謝途徑尚不清楚。CHS是黃酮合成途徑中的第一個關鍵酶,在植物黃酮代謝中發(fā)揮著重要作用。漫長的進化過程中,CHS基因在不同植物譜系中發(fā)生了不同程度的重復和分化,導致在多數(shù)植物基因組中出現(xiàn)由CHS基因分化形成的CHSlike基因,組成了查爾酮合成酶基因超家族(Chalcone synthase superfamily)。到目前為止已在種子、蕨類,苔蘚植物中分離到多種查爾酮合成酶超家族基因,但在蕨類植物中查爾酮合成酶超家族基因的種類及功能尚不明確。研究蕨類植物中查爾酮合成酶超家族基因,對闡明黃酮代謝途徑的分子機制,揭示查爾酮合成酶超家族基因的功能及其演化均具有重要的科學意義。本研究以紅蓋鱗毛蕨為實驗材料,應用轉錄組測序、PCR及高效液相色譜技術對查爾酮合成酶超家族基因進行克隆、表達分析及功能研究,并對該基因序列進行了生物信息學分析。本研究的實驗結果主要有以下幾個方面:1.利用Ilumina Hiseq 2000平臺對紅蓋鱗毛蕨拳卷葉進行測序,獲得8.5G數(shù)據(jù)量。對獲得的數(shù)據(jù)進行組裝拼接,共獲得Unigene 143604條。依據(jù)注釋結果分析獲得CHS可能性基因28條,經(jīng)分析選取其中4條作為CHS的候選基因。2.根據(jù)轉錄組測序技術,成功克隆到四條CHS候選基因的ORF序列,將該四條基因序列重新命名為:DeCHS、DeCHSlike1、DeCHSlike2和DeCHSlike3。生物信息學分析表明,DeCHS的ORF全長1212bp,編碼403個氨基酸;DeCHSlike1的ORF全長1371bp,編碼456個氨基酸;DeCHSlike2的ORF全長1506bp,編碼501個氨基酸;DeCHSlike3的ORF全長1332bp,編碼443個氨基酸。3.運用In-fusion連接技術,成功構建四條CHS的重組質(zhì)粒pET28aDeCHS、pET28a-DeCHSlike1、pET32a-DeCHSlike2、pET32a-DeCHSlike3。將重組質(zhì)粒導入到BL21感受態(tài)細胞中構建原核表達載體,并用IPTG誘導獲得融合蛋白,經(jīng)SDS-PAGE鑒定獲得蛋白大小分別為44.2KD、48.3 kDa、68.5 kDa、64.6 kDa,與預期的蛋白大小相一致。4.本研究以丙二酰CoA、香豆酰CoA、苯乙酰CoA、乙酰CoA和異戊酰CoA為底物,分別采用四條基因表達的融合蛋白對底物進行催化,對催化產(chǎn)物進行高效液相色譜(HPLC)檢測,結果表明:DeCHS蛋白既能催化香豆酰CoA和丙二酰CoA反應也能催化苯乙酰CoA和丙二酰CoA反應產(chǎn)生柚皮素,和已報道的植物CHS基因功能一致。DeCHSlike1蛋白可催化香豆酰CoA和丙二酰CoA反應產(chǎn)生柚皮素,但不能催化苯乙酰CoA和丙二酰CoA反應。在以乙酰CoA、異戊酰CoA和丙二酰CoA反應時均能產(chǎn)生產(chǎn)物,但產(chǎn)物未知。DeCHSlike2、DeCHSlike3蛋白可催化香豆酰CoA、苯乙酰CoA和丙二酰Co A反應產(chǎn)生柚皮素;也可催化異戊酰CoA和丙二酰CoA反應產(chǎn)生6-異丁基-4-羥基-2-吡喃酮,但以乙酰CoA和丙二酰CoA作為底物時,產(chǎn)物不同,因此二者在功能上存在差異,需要進一步探究。本研究發(fā)現(xiàn)紅蓋鱗毛蕨具有不同類型的CHS基因,但其功能尚未產(chǎn)生明顯的分化。經(jīng)分析DeCHS與已報道的植物CHS基因功能相同;DeCHSlike1既具有CHS基因功能也具有CHSlike基因的功能;DeCHSlike2、DeCHSlike3可催化異戊酰CoA和丙二酰CoA反應產(chǎn)生中間產(chǎn)物6-異丁基-4-羥基-2-吡喃酮,具有VPS的功能,表明DeCHSlike2和DeCHSlike3均為CHSlike類型。綜上所述,紅蓋鱗毛蕨中具有查爾酮合成酶超家族基因。
【學位單位】：上海師范大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：Q943.2
【部分圖文】：

圖 1-1 黃酮類化合物基本結構ure 1-1 The elementary structure of flav化程度、苯環(huán)的連接位置以及分為六大類（圖 1-2）：黃酮類類（flavanones）、黃酮醇類（

圖 1-2 主要的黃酮類化合物的結構圖Figure 1-2 Structures of major classes of flavonoids化合物具有多種生物功能，如參與防御、紫外線防護、抑制作用、花著色和參與生殖過程等作用[49-51]。同時，黃酮類化

圖 1-3 黃酮類化合物的生物合成路線[55]Figure 1-3 A schematic presentation of the flavonoids biosynthetic pathway[55]1.2.3 黃酮合成途徑中的關鍵酶基因研究進展
【參考文獻】

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本文編號：2875272