人血清白蛋白(HSA)是人血漿中的蛋白質(zhì),其非糖基化的單鏈多肽包含585個氨基酸,分子量為66kD。在臨床上HSA可用于治療休克與燒傷,用于補充因手術(shù)、意外事故或大出血所致的血液丟失,也可以作為血漿增容劑。在臨床和生物技術(shù)中具有重要作用,存在巨大的市場需求,單純靠人血液提取HSA是難以滿足市場需求的。而且人血來源容易導(dǎo)致各種污染以及疾病的傳播。為擺脫血漿來源有限的產(chǎn)能限制以及解決利用血漿來源的市售HSA存在傳染病毒等的風險,利用植物生產(chǎn)抗體等藥用蛋白或治療性蛋白是植物生物反應(yīng)器的一個重要應(yīng)用領(lǐng)域。小立碗蘚(Physcomitrella patens)在生物技術(shù)中用作重組治療性蛋白質(zhì)和具有商業(yè)價值的天然產(chǎn)物的異源表達宿主具有很大的優(yōu)勢。因其生活史周期短,易于培養(yǎng),轉(zhuǎn)基因植株易于分析。而且,小立碗蘚是陸生植物中基因重組率最高的植物,有“綠色酵母”之稱。其核基因組易于與有同源片段的外源DNA發(fā)生高頻率的同源重組,小立碗蘚以單倍體的形式克隆生長使得其遺傳變異水平相對較低。這些優(yōu)勢有利于遺傳轉(zhuǎn)化及基因操作后的篩選。小立碗蘚全基因組測序已完成,這使得其生物信息學研究及功能基因組對比可以進行。所以選取小立碗蘚作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組HSA(rHSA)。利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將外源基因轉(zhuǎn)入小立碗蘚的實例在國內(nèi)外還沒有被報道。具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下:1、將pYB1906載體進行改造,利用PTDS基因合成方法人工合成了rHSA基因并連接入pYB1906載體構(gòu)建了新的植物載體pYB2924,該載體在HSA基因的5’端引入了小立碗蘚MTH1蛋白分泌信號肽序列,便于實現(xiàn)在小立碗蘚中的分泌表達。2、利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)小立碗蘚轉(zhuǎn)化體系,通過農(nóng)桿菌侵染原生質(zhì)體的方法將pYB2924基因?qū)胄×⑼胩\中,得到了具有潮霉素(HYG)抗性的陽性小立碗蘚轉(zhuǎn)化植株。并且成功培養(yǎng)出能夠分泌rHSA的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化株,建立了成熟的農(nóng)桿菌介導(dǎo)體系。3、將篩選出的陽性轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)過PCR擴增以及RT-PCR檢測證實pYB2924基因已整合入小立碗蘚的基因組并在轉(zhuǎn)錄水平得到了表達,利用SDS-PAGE蛋白電泳證實了該蛋白的表達,最后用ELISA檢測證明在小立碗蘚中分泌出了rHSA,根據(jù)ELISA測定結(jié)果,其表達量為27mg/L。
【學位單位】：上海師范大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：Q943.2
【部分圖文】：

4、將電擊杯中的混合液混勻轉(zhuǎn)移至 1.5mL 離心管中搖床培養(yǎng) 1h。5、吸取 80μL 涂抗性板篩選轉(zhuǎn)化子，28℃培養(yǎng)。6、10%甘油保存。2.4 結(jié)果分析2.4.1 rHSA 基因的序列測定序列測定由上海生工公司代為測定（見附錄）。2.4.2 植物表達載體的構(gòu)建將上述測序正確的質(zhì)粒經(jīng)過 BamHI 和 SacI 酶切連接入經(jīng)過同樣酶切的植物載體 pYB1906 中。對形成的重組載體 pYB2924 進行酶切鑒定。預(yù)計片段長度為1848bp 和 5824bp，結(jié)果如下圖，與預(yù)期結(jié)果一致。

圖 2-3 PTDS 法合成的 rHSA 基因檢測體（pYB2924）具有以下特點:，是在 pCamBIA-1301 載體的基基因，CaMV35S 啟動子控制 Ori 位點，可以在大腸桿菌中進接合轉(zhuǎn)移有關(guān)。選標記基因。該載體還帶有廣宿ta，可以在其它 G-細菌中進行復(fù)’ 端 引 入 了 編 碼 小 立 碗 蘚rolase1 (PpXTH1 [EMBLAJ8432中的分泌表達，終止子選擇根癌1 的 5’端用來控制 HSA 基因的

-4 pYB2924 的轉(zhuǎn)化鑒定 a. pYB2924 電擊轉(zhuǎn)化論于人血來源的 HSA 的量有限，而市場對足市場的需求，而利用同源重組率很高程度上為植物生產(chǎn) HSA 可以應(yīng)用于生物化學合成全基因序列技術(shù)已經(jīng)較為成熟方面的探索研究，甚至憑借基因工程技 PCR、DNA 改組（DNA shuffling）PCRp DNAsynthesis）法[79,80,81]等以上這些方合成。除以上方法以外還可利用 DNA 合段一般不超過 90bp[82]。本實驗是通過 P因，并且在 HSA 基因的 5’端引入蛋白
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2 李登科,吳鵬程;小立碗蘚屬在中國的記錄(英文)[J];植物分類學報;1995年01期

3 沙畢熱木·斯熱義力;張龍鋒;美麗排提·玉素甫;阿提古麗·毛拉;買買提明·蘇來曼;;新疆葫蘆蘚科立碗蘚屬一新記錄種——球蒴立碗蘚[J];華中師范大學學報(自然科學版);2018年01期

4 高佳;田桂泉;趙東平;;內(nèi)蒙古葫蘆蘚科和叢蘚科植物新資料[J];內(nèi)蒙古大學學報(自然科學版);2017年02期

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1 朱彥滿;農(nóng)桿菌介導(dǎo)的人血清白蛋白基因在小立碗蘚中的轉(zhuǎn)化及表達研究[D];上海師范大學;2018年

2 楊思思;灰霉菌脅迫下小立碗蘚轉(zhuǎn)錄組測序研究[D];貴州師范大學;2017年

本文編號：2875031