黑毛雪兔子(Saussurea hypsipeta Diels),屬菊科(Compositae)風(fēng)毛菊屬(Saussurea DC.),是一種生長于青藏高原地區(qū)的珍稀、瀕危藥用植物。同時,它又是一種典型的高山植物。植株密被表皮毛是黑毛雪兔子最具有代表性的形態(tài)特征,并且是黑毛雪兔子對極端環(huán)境適應(yīng)的一種特殊結(jié)構(gòu)。研究黑毛雪兔子表皮毛的形成和發(fā)育過程,對揭示高山植物適應(yīng)環(huán)境的特殊機(jī)制將具有重要的理論意義。為此,本研究以黑毛雪兔子作為實(shí)驗(yàn)材料,在建立起黑毛雪兔子離體再生體系的基礎(chǔ)上,通過RT-PCR,結(jié)合RACE技術(shù),克隆了與表皮毛發(fā)育相關(guān)的基因TTG1,并研究了該基因的功能。主要研究結(jié)果如下:1.以野生苗葉片為外植體,通過愈傷組織途徑建立了植株再生體系。以MS為基本培養(yǎng)基,附加2.0 mg·L~(-1) 2,4-D和0.5 mg·L~-11 6-BA,適于愈傷組織的誘導(dǎo);愈傷組織在含有0.5 mg·L~(-1) 2,4-D的MS培養(yǎng)基上繼代后,在附加1.0 mg·L~(-1) 6-BA和0.2 mg·L~(-1) NAA的MS培養(yǎng)基上,愈傷組織分化率為84.45%;在附加0.2mg·L~(-1) IAA和0.2%活性炭的1/2 MS培養(yǎng)基上,再生芽的生根率為82.2%;再生植株移栽到盆土中,大約有16.7%的苗存活,并能夠正常的生長。以再生苗葉片為外植體,通過不定芽的直接誘導(dǎo)建立了植株再生體系。以MS為基本培養(yǎng)基,附加0.5 mg·L~(-1) 6-BA和0.5 mg·L~(-1) NAA,適于葉片不定芽的直接誘導(dǎo),平均每個外植體產(chǎn)生4.7個不定芽。2.克隆得到黑毛雪兔子TTG1基因。TTG1基因cDNA全長1378 bp,包含1014 bp的開放閱讀框,118 bp的5’端非編碼區(qū),225 bp的3’端非編碼區(qū)和21bp的ploy(A)尾巴。該基因共編碼337個氨基酸殘基,分子量為37.47 kDa,等電點(diǎn)4.82。同源比對顯示,推導(dǎo)出來的氨基酸序列與同一屬植物水母雪蓮(Saussurea medusa)的同源性為95.25%,與擬南芥(Arabidopsis thaliana)、煙草(Nicotiana tabacum)、黃瓜(Cucumis sativus)的同源性分別為73.91%、73.33%和74.78%。黑毛雪兔子TTG1基因的氨基酸序列有5個WD40 repeat,說明該基因可能編碼一種WD40蛋白,將該基因命名為ShTTG1(MF805763)。同時,克隆得到黑毛雪兔子ShTTG1基因的一對等位基因,命名為ShTTG1a(MG564780)和ShTTG1b(MG564781),基因長度均為1328 bp,CDS區(qū)為1014bp,編碼337個氨基酸;等位基因之間有3個核苷酸差異位點(diǎn),在CDS區(qū)有1個差異位點(diǎn),導(dǎo)致所編碼的多肽序列在250位點(diǎn)上的氨基酸存在差異,ShTTG1a為亮氨酸,ShTTG1b為甲硫氨酸。3.采用qRT-PCR技術(shù),檢測黑毛雪兔子5個內(nèi)參基因(Actin、18S rRNA、GAPDH、EF1α和TUA)在不同組織中,以及低溫脅迫(4℃)和紫外脅迫處理下葉組織中的表達(dá)情況。在Delta Ct、geNorm、Best Keeper和Norm Finder軟件分析的基礎(chǔ)上,利用Ref Finder在線工具綜合分析5個內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。結(jié)果表明,在不同組織中表達(dá)最穩(wěn)定的是GAPDH;在低溫脅迫下表達(dá)最穩(wěn)定的是18S rRNA;在紫外脅迫下表達(dá)最穩(wěn)定的是Actin。為黑毛雪兔子相關(guān)基因的表達(dá)研究提供了較穩(wěn)定的內(nèi)參基因。以GAPDH作為內(nèi)參基因,檢測ShTTG1基因在黑毛雪兔子根、莖、葉和花中的表達(dá)情況。結(jié)果表明,ShTTG1基因在4種組織中都有表達(dá),其中在葉中的表達(dá)量最高。將ShTTG1基因連接到pColdⅠDNA表達(dá)載體,構(gòu)建了原核表達(dá)載體pColdⅠDNA::ShTTG1,并導(dǎo)入到BL21(DE3)大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物用SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果表明,目的蛋白在大腸桿菌中表達(dá),表達(dá)蛋白的分子量接近40 kDa,與預(yù)測的融合蛋白分子量大小相符。4.構(gòu)建了ShTTG1基因的超表達(dá)載體35S::ShTTG1,在根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)下,將目的基因ShTTG1轉(zhuǎn)入本氏煙草(Nicotiana benthamiana)中。通過PCR和RT-PCR檢測,獲得3株轉(zhuǎn)基因煙草植株。形態(tài)學(xué)比較表明,轉(zhuǎn)基因植株葉柄和葉片上的表皮毛較長,且在表皮毛密度上與對照有顯著差異。構(gòu)建了ShTTG1基因的亞細(xì)胞定位載體35S::ShTTG1-GFP。共聚焦結(jié)果顯示,ShTTG1蛋白定位于細(xì)胞核中,這符合轉(zhuǎn)錄因子的特征。將35S::ShTTG1-GFP載體轉(zhuǎn)化本氏煙草。在轉(zhuǎn)基因煙草葉片中,除了葉脈外,表皮毛中也有較強(qiáng)的熒光信號,推測ShTTG1基因與表皮毛發(fā)育有關(guān)。對黑毛雪兔子進(jìn)行了紫外和低溫脅迫處理。結(jié)果表明,在紫外處理下,ShTTG1基因的表達(dá)量在3 h后顯著提高,之后下降。而在低溫處理下,ShTTG1基因的表達(dá)量與對照組差異不顯著,推測黑毛雪兔子的表皮毛可能是針對紫外輻射的一種適應(yīng)結(jié)構(gòu)。
【學(xué)位單位】：青海大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S567.239
【部分圖文】：

、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期調(diào)控等過程[17]。由于擬南芥表皮毛結(jié)構(gòu)特殊，屬，并廣泛分布于花瓣、莖、莖生葉和蓮座葉上，有利于細(xì)胞生命周期，發(fā)生，起源和發(fā)育的研究。（1）擬南芥表皮毛的形態(tài)發(fā)育擬南芥表皮毛在發(fā)育初期有絲分裂活動停止，特定的表皮毛細(xì)胞開始膨變大，細(xì)胞核開始復(fù)制（圖 1.1A1）；經(jīng)過 3 次核內(nèi)復(fù)制，其 DNA 含量長[18]；隨著植物表皮毛的發(fā)育，表皮毛主干結(jié)構(gòu)逐漸形成，原表皮細(xì)胞膨向外延伸（圖 1.1 A2）；垂直凸起的頂端細(xì)胞，圍繞凸起頂點(diǎn)開始形成支（圖 1.1 A3）；表皮毛頂端形成凸起后，細(xì)胞整體增大，細(xì)胞核進(jìn)行，細(xì)胞接著進(jìn)行彌散性生長，大多數(shù)表皮細(xì)胞最終形成 3 個分支（圖 1.1A；伸長階段鈍狀的表皮形成分支，并沿著整個細(xì)胞軸線延伸，隨著分支的逐漸變尖（圖 1.1B5）[20]；表皮細(xì)胞形成完整的表皮毛后，在表皮毛表數(shù)量不等的玻璃狀乳突，并有起支撐作用的表皮細(xì)胞圍繞在成熟表皮毛部（圖 1.1 B6）[21]。

毛的發(fā)生[44]。GL1 和 TTG1 的等位基因之間的互作，不但能夠產(chǎn)生發(fā)育不完全的表皮毛簇，還會出現(xiàn)非特異性表皮毛簇的增加[45]。這些都說明，TTG1 和 GL1 都能限制表皮毛的啟動，并且 TTG1 和 GL1 作為復(fù)合體共同發(fā)揮作用。綜上所述，TTG1 和 GL1 基因在表皮毛發(fā)育調(diào)控中進(jìn)行平衡調(diào)節(jié)，控制表皮毛啟動與限制表皮毛發(fā)生。TRY 蛋白能夠與 GL1 和 TTG1 互作，來改變 GL1 和 TTG1 復(fù)合體的活性，并影響表皮毛發(fā)育啟動活性。研究發(fā)現(xiàn)，TRY 主要介導(dǎo)早期表皮毛周邊細(xì)胞的側(cè)向抑制，在 TRY 突變體中，約 5%～10%的表皮毛成簇存在，現(xiàn)已有實(shí)驗(yàn)證明 TRY 主要功能是側(cè)向抑制[46]。在 CPC 轉(zhuǎn)錄因子研究中發(fā)現(xiàn)，CPC 轉(zhuǎn)錄因子功能與 TRY 相同，在過表達(dá)試驗(yàn)中 CPC 基因抑制了擬南芥表皮毛的發(fā)生，推測 CPC 基因?qū)儆谪?fù)調(diào)節(jié)基因[47]。在互作實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，GL2 能夠調(diào)控根毛表皮細(xì)胞的發(fā)育，在此過程中受 MYB-bHLH-TTG1 復(fù)合體的影響。（3）擬南芥表皮毛分化的調(diào)控模型目前，在擬南芥中有兩種表皮毛發(fā)育模型在共同發(fā)揮作用，即激活抑制模型（Activator-Inhibitor Model）和激活消耗模型（Activator-Depletion Model）。

（圖 1.2）[48]。近幾年的相關(guān)研究闡明，GL1 和 TTG1 都能夠與 bHLH 轉(zhuǎn)錄因子類基因 GL3、EGL3 相互作用，并形成 MYB-bHLH-WD40 蛋白復(fù)合物，正向調(diào)控表皮毛起始；隨著表皮毛起始復(fù)合物 MYB-bHLH-WD40 的積累，達(dá)到一定量時，就能夠激活 GL2 的表達(dá)，促進(jìn)表皮毛形成。由于 GL2 屬于含有 HD-Zip 結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，作為表皮毛的正向調(diào)控因子，在表皮毛形成中發(fā)揮重要的作用[48][50]。
【相似文獻(xiàn)】

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1 霍建青;;青海省海北州菊科風(fēng)毛菊屬植物種類的開發(fā)利用[J];畜牧與飼料科學(xué);2012年09期

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1 史國民;黑毛雪兔子表皮毛發(fā)育相關(guān)基因ShTTG1的克隆及功能研究[D];青海大學(xué);2018年

本文編號：2874293