發(fā)布時(shí)間：2020-11-07 14:04

　　 葡萄果皮色澤是果實(shí)重要的外觀品質(zhì)之一,也是決定葡萄酒質(zhì)量的關(guān)鍵因素,而果皮顏色主要是由花色苷含量及組成成分決定�；ㄉ盏纳锖铣芍饕芙Y(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因的控制。本文采用酵母雙雜交(yeast two-hybrid system)、酵母單雜交(yeast one-hybrid system)和病毒誘導(dǎo)基因沉默(virus induced gene silencing)等技術(shù),對(duì)葡萄轉(zhuǎn)錄因子mybA1與花色苷生物合成結(jié)構(gòu)基因UFGT、DFR作用機(jī)制及mybA1轉(zhuǎn)錄因子沉默后花色苷含量、花色苷合成通路中關(guān)鍵酶的表達(dá)量進(jìn)行分析,以期闡明轉(zhuǎn)錄因子myb41在花色苷合成通路中調(diào)控機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:1、葡萄果實(shí)VIGS體系建立以'紅地球'轉(zhuǎn)色期葡萄果實(shí)為試材,將VvmybA1編碼區(qū)422-753反向插入pTRV2載體上,分別將pTRV2-mybA1和pTRV1轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中,以O(shè)D600=0.5、1、1.5、3的菌液濃度,在真空條件下侵染葡萄果實(shí),然后于26℃,16h光照,8h黑暗的條件下培養(yǎng)。15d后,發(fā)現(xiàn)OD600=1的菌液濃度效果最好。2、轉(zhuǎn)錄因子myb41功能分析采用OD600=1的菌液濃度侵染'極早蜜',培養(yǎng)10d,處理組幾乎均保持綠色,而對(duì)照組則呈紅色,繼續(xù)培養(yǎng)5d后,處理組依然保持綠色�；ㄉ諟y(cè)定結(jié)果表明:對(duì)照組中'紅地球'和'極早蜜'中花色苷含量分別是處理組的1.36、5.00倍,且在'極早蜜'中為顯著性差異(P0.05)。RT-PCR分析結(jié)果表明,處理組mybA1表達(dá)量極低;qPCR分析結(jié)果顯示:mybA41、mybA2、DFR、UFGT在'紅地球'中基因表達(dá)量下降分別為:73%、47%、80%、8%(對(duì)照表達(dá)量以 100%計(jì)算).,mybA1、mybA2、DFR、UFGT、LAR1、LAR2、ANR、ANS在'極早蜜'中基因表達(dá)量下降分別為:97%、95%、72%、42%、45%、53%、73%、99%(對(duì)照表達(dá)量以100%計(jì)算)。差異顯著性分析表明:在'紅地球'中mybA1、DFR與對(duì)照相比為極顯著差異(P0.01),mybA2為顯著差異(P0.05);在'極早蜜'中,mybA1、mybA2、DFR、ANS與對(duì)照相比為極顯著差異(P0.01),UFGT、LAR1、LAR2、ANR顯著差異(P0.05)。3、蛋白互作分析根據(jù)V mvmybA1、VvUFGT、VvDFR CDS 序列和 pGBKT7、pGADT7 多克隆酶切位點(diǎn),構(gòu)建重組質(zhì)粒 pGBKT7-mybA1、pGBKT7-DFR、pGBKT7-UFGT、pGADT7-mybA1。轉(zhuǎn)錄激活功能分析及毒性檢測(cè)結(jié)果表明,Vvmyb41編碼的蛋白具有轉(zhuǎn)錄激活功能,VvUFGT、VvDFR編碼的蛋白不具有轉(zhuǎn)錄激活功能且無(wú)毒無(wú)害。酵母雙雜交結(jié)果表明,在酵母水平中mybA1蛋白與UFGT、DFR蛋白均不互作。4、DNA-蛋白質(zhì)作用分析從葡萄基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得UFGT、DFR啟動(dòng)子序列,用PLANTCARE預(yù)測(cè)啟動(dòng)子上的作用元件,獲得與MYB結(jié)合的MBS順式作用元件,將MBS順式作用元件串聯(lián)獲得誘餌元件序列,MBS順式作用元件突變?yōu)殛幮詫?duì)照,將pGADT7-mybA1分別與pMBS(UFGT)-AbAi、pMBS(DFR)-AbAi共轉(zhuǎn)化的酵母菌Y1Hgold細(xì)胞(試驗(yàn)組)、pGADT7-mybA1 分別與 p[Mutant(UFGT)]-AbAi、p[Mutant(DFR)]-AbAi 共轉(zhuǎn)化的Y1Hgold酵母菌(陰性對(duì)照)和p53-AbAi與pGAD-Rec-p53共轉(zhuǎn)化的酵母菌(陽(yáng)性對(duì)照)分別涂于SD/-Ura/-Leu/100 mM Aba固體平板上,結(jié)果顯示,試驗(yàn)組與陽(yáng)性對(duì)照均能在固體平板上生長(zhǎng),而陰性對(duì)照不能生長(zhǎng),證明VvmybA1編碼的蛋白能夠識(shí)別VvUFGT、VvDFR基因啟動(dòng)子。
【學(xué)位單位】：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S663.1
【部分圖文】：

圖３ＶＩＧＳ作用機(jī)制＿??Ｆｉｇ．３?Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ?ｏｆ?ｖｉｒｕｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ?ｇｅｎｅ?ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ網(wǎng)??Ｓ?應(yīng)用??學(xué)的發(fā)展，對(duì)未知植物基因功能的研究成了研究熱點(diǎn)，而基因組測(cè)的提供大量信息，因此就需要快速高效的基因功能鑒定方法。轉(zhuǎn)基的鑒定基因功能的一種方法，但因操作復(fù)雜、轉(zhuǎn)化效率低、周期長(zhǎng)的木本植物較為難實(shí)施；而ＶＩＧＳ技術(shù)能夠彌補(bǔ)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不足，短、沉默效率高、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，且整個(gè)過(guò)程并不需要通過(guò)組織培養(yǎng)再轉(zhuǎn)基因植株，從而大大節(jié)省了物種基因功能分析所需的時(shí)間優(yōu)點(diǎn)，其已成為一種廣泛、高效的方法被用來(lái)進(jìn)行功能分析。??反應(yīng)??

如果在酵母水ｆ？中，誘餌蛋白和靶蛋白相互作用，則轉(zhuǎn)朵因子的結(jié)合域和激??活域被拉近，當(dāng)足夠靠近，報(bào)告基因被起始轉(zhuǎn)糸；反之，報(bào)告基因?qū)⒉槐磉_(dá)１？。因此，??報(bào)告椹Ｗ的表達(dá)４古被作為蛋白質(zhì)凡作情況的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。酵母雙雜交原理示意圖４丨７１１。??／?ＧＡＬ４Ａ０?＼??ＳＬｉｌｒａｒｙ?ｐｒｏｔｏｎ??????ｔｒａａｓｃｒｉｐｔｌｏＢ??－ｇａｌｕａｓ?二：ｎ〇ｔｏｒ￣??圖４酵母雙雜交原理［７１］??Ｆｉｇ．?４?ｔｈｅ?ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ?ｏｆ?ｙｅａｓｔ?ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ?ｓｙｓｔｅｍ＊７１１??１．３．２酵母雙雜交應(yīng)用??（１）在蛋白質(zhì)組學(xué)方面的應(yīng)用??１１??

基因的表達(dá)，篩選出與已知順式元件結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子［９５］。即相比較于酵母雙雜交，在酵??母單雜交體系中，省略了?ＢＤ－Ｘ蛋白質(zhì)雜交體，而用特異的ＤＮＡ序列取代ＤＮＡＧａｌ４ｐ??結(jié)合位點(diǎn)［％１。酵母單雜交原理如圖５［９８】。??／ｃＤＮＡ＞．??庫(kù)篩??酵聊＾＼??，基ＩＩ編碼產(chǎn)物＼??（??（＾轉(zhuǎn)錄因０?達(dá)）??顒式元件順元件式＾?Ｐｍｉｎ?ＥＥＳ？Ｕ／??圖５酵母單雜交原理??Ｆｉｇ．?５?ｔｈｅ?ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ?ｏｆ?ｙｅａｓｔ?ｏｎｅ－ｈｙｂｒｉｄ?ｓｙｓｔｅｍ＾??１．４．２酵母單雜交應(yīng)用??（１）
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本文編號(hào)：2874044