目的:研究下調(diào)圍脂滴蛋白基因(PLIN1)表達(dá)對(duì)3T3-L1細(xì)胞脂解的影響。方法:采用RNA干擾技術(shù),構(gòu)建3組陽(yáng)性及1組陰性sh-PLIN1重組載體,并進(jìn)行菌液PCR和DNA測(cè)序鑒定。Western blot測(cè)定PLIN1A蛋白表達(dá),評(píng)價(jià)載體下調(diào)效果。細(xì)胞轉(zhuǎn)染有效載體2天后,Bodipy 493/503染色脂滴;酶學(xué)方法測(cè)定細(xì)胞中甘油三酯和甘油含量;Western blot檢測(cè)甘油三酯脂肪酶(ATGL)、激素敏感性脂肪酶(HSL)及其磷酸化蛋白(p-HSL)的表達(dá)。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定細(xì)胞中環(huán)磷酸腺苷(c AMP)和蛋白激酶A(PKA)的濃度。結(jié)果:各sh-PLIN1干擾載體構(gòu)建成功,且3組陽(yáng)性載體均能顯著下調(diào)PLIN1A蛋白的表達(dá)(P0.05)。轉(zhuǎn)染有效載體后,與陰性轉(zhuǎn)染組相比,sh-PLIN1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中脂滴減小,甘油三酯含量降低,甘油含量升高,ATGL和HSL相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P0.05),p-HSL相對(duì)表達(dá)量及c AMP、PKA的濃度無(wú)顯著性差異(P0.05)。結(jié)論:下調(diào)PLIN1基因表達(dá)可加快3T3-L1細(xì)胞脂解速率,其可能通過(guò)上調(diào)ATGL和HSL的表達(dá)而實(shí)現(xiàn),c AMP/PKA信號(hào)通路對(duì)其無(wú)明顯調(diào)節(jié)作用。
【部分圖文】：

2016，36(3)趙志武等:下調(diào)Perilipin1基因表達(dá)對(duì)3T3-L1細(xì)胞脂解的影響量分光光度計(jì)測(cè)定，其A260/A280值均介于1．8左右，符合純度要求;4組的質(zhì)粒濃度分別為(171．7±9．5)ng/μl、(184．2±9．5)ng/μl、(138．0±8．2)ng/μl和(241．1±10．7)ng/μl。質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，4組目的條帶均約為6400bp，與預(yù)測(cè)結(jié)果一致，說(shuō)明質(zhì)粒提取準(zhǔn)確(圖1)。另外，DNA測(cè)序鑒定結(jié)果與4組設(shè)計(jì)的序列完全一致，進(jìn)一步證實(shí)各sh-PLIN1重組載體構(gòu)建成功。圖1sh-PLIN1重組載體鑒定Fig．1Identificationofsh-PLIN1vector(a)BacteriumliquidPCＲreactionofsh-PLIN1recombinantvectors1:sh-PLIN1-1group;2:sh-PLIN1-2group;3:sh-PLIN1-3group;4:sh-PLIN1-4group(negativecontrolgroup);5:ddH2Ogroup;6:Emptyvectorgroup;M:DNAmaker(b)Gelelectrophoresisofeveryrecombinantplasmid1:sh-PLIN1-1group;2:sh-PLIN1-2group;3:sh-PLIN1-3group;4:sh-PLIN1-4group2．2轉(zhuǎn)染效率及PLIN1A蛋白表達(dá)細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化6天和轉(zhuǎn)染2天處理后，sh-PLIN1-1組、sh-PLIN1-2組、sh-PLIN1-3組和sh-PLIN1-4組細(xì)胞轉(zhuǎn)染率分別為(47．2±5．4)%、(43．6±6．3)%、(44．2±5．0)%和(48．5±7．1)%，均適用于PLIN1下調(diào)效果測(cè)定。經(jīng)Westernblot檢測(cè)，與sh-PLIN1-4組相比，sh-PLIN1-1組、sh-PLIN1-2組和sh-PLIN1-3組PLIN1A蛋白表達(dá)量顯著下降(P＜0．05)，而未轉(zhuǎn)染組無(wú)明顯差異(P＞0．05)，表明3組陽(yáng)性sh-PLIN1重組載體均可有效下調(diào)PLIN1A蛋白的表達(dá)(圖2)。隨后用sh-PLIN1-1陽(yáng)性載體作為sh-PLIN1轉(zhuǎn)染組，sh-PLIN1-4陰性載體作為陰性轉(zhuǎn)染組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。2．3sh-PLIN1載體對(duì)脂滴形態(tài)的影響經(jīng)Bodipy493/503和Hoechst33258染色后，3組細(xì)胞中脂滴(綠色熒光)均圍繞細(xì)

A蛋白表達(dá)量顯著下降(P＜0．05)，而未轉(zhuǎn)染組無(wú)明顯差異(P＞0．05)，表明3組陽(yáng)性sh-PLIN1重組載體均可有效下調(diào)PLIN1A蛋白的表達(dá)(圖2)。隨后用sh-PLIN1-1陽(yáng)性載體作為sh-PLIN1轉(zhuǎn)染組，sh-PLIN1-4陰性載體作為陰性轉(zhuǎn)染組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。2．3sh-PLIN1載體對(duì)脂滴形態(tài)的影響經(jīng)Bodipy493/503和Hoechst33258染色后，3組細(xì)胞中脂滴(綠色熒光)均圍繞細(xì)胞核(藍(lán)色熒光)分布，出現(xiàn)典型的“花環(huán)型”結(jié)構(gòu)。與陰性轉(zhuǎn)染組相比，sh-PLIN1轉(zhuǎn)染組中直徑大于2μm的脂滴所占比例下降50．1%，而小于1μm的脂滴所占比例增加1．69倍，說(shuō)圖23T3-L1細(xì)胞中PLIN1A蛋白表達(dá)Fig．2ExpressionofPLIN1Aproteinin3T3-L1adipocytes(a)WesternblotassayofPLIN1Aexpression(b)ＲelativelevelofPLIN1A(a)，(b)TheproteinlevelofPLIN1A1:sh-PLIN1-1group;2:sh-PLIN1-2group;3:sh-PLIN1-3group;4:sh-PLIN1-4group(negativecontrolgroup);5:Notransfectiongroup;a:P＜0．05明sh-PLIN1轉(zhuǎn)染組中脂滴減校另外，陰性轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組中脂滴形態(tài)無(wú)明顯差異(圖3、圖4)。圖3脂滴熒光染色Fig．3Fluorescencestainingoflipiddroplets(rule=25μm)2．4sh-PLIN1載體對(duì)細(xì)胞內(nèi)甘油三酯和甘油含量的影響與陰性轉(zhuǎn)染組比較，sh-PLIN1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量下降，甘油含量升高，兩者差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義19

跣宰?咀橄啾齲?sh-PLIN1轉(zhuǎn)染組中直徑大于2μm的脂滴所占比例下降50．1%，而小于1μm的脂滴所占比例增加1．69倍，說(shuō)圖23T3-L1細(xì)胞中PLIN1A蛋白表達(dá)Fig．2ExpressionofPLIN1Aproteinin3T3-L1adipocytes(a)WesternblotassayofPLIN1Aexpression(b)ＲelativelevelofPLIN1A(a)，(b)TheproteinlevelofPLIN1A1:sh-PLIN1-1group;2:sh-PLIN1-2group;3:sh-PLIN1-3group;4:sh-PLIN1-4group(negativecontrolgroup);5:Notransfectiongroup;a:P＜0．05明sh-PLIN1轉(zhuǎn)染組中脂滴減校另外，陰性轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組中脂滴形態(tài)無(wú)明顯差異(圖3、圖4)。圖3脂滴熒光染色Fig．3Fluorescencestainingoflipiddroplets(rule=25μm)2．4sh-PLIN1載體對(duì)細(xì)胞內(nèi)甘油三酯和甘油含量的影響與陰性轉(zhuǎn)染組比較，sh-PLIN1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量下降，甘油含量升高，兩者差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義19
【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2873629