水曲柳(Fraxinus mandshurica Rupr.)為木犀科梣樹(shù)屬的落葉喬木,是我國(guó)東北地區(qū)珍貴的闊葉樹(shù)種。水曲柳不僅具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,還有重要的生態(tài)價(jià)值。近幾年,課題組對(duì)水曲柳組織培養(yǎng)及體胚發(fā)生等方面進(jìn)行了細(xì)致的研究,但在體胚誘導(dǎo)研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)大量的畸形胚,大量研究表明,在參與誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的基因中,蛋白激酶類是生物生命活動(dòng)中極其重要的一類蛋白,其中SERK基因作為體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程中胚性細(xì)胞的一種標(biāo)記,標(biāo)記胚性細(xì)胞的形成到胚胎發(fā)生這一過(guò)程。同時(shí),SERK基因有可能大范圍的參與了除植物生長(zhǎng)發(fā)育外的其它生物學(xué)過(guò)程。為深入了解水曲柳體細(xì)胞胚胎發(fā)生機(jī)理,本研究以水曲柳成熟胚和未成熟胚為外植體誘導(dǎo)體細(xì)胞胚及愈傷組織,采用同源克隆法對(duì)體細(xì)胞胚發(fā)生相關(guān)的SERK基因進(jìn)行分離克隆,獲得cDNA全長(zhǎng),并利用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)水曲柳不同器官、組織及不同發(fā)育時(shí)期的體細(xì)胞胚進(jìn)行表達(dá)分析,以期為水曲柳體胚發(fā)生機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)。通過(guò)研究結(jié)果如下:1.分別以水曲柳未成熟胚和成熟胚為外植體,在MS1/2培養(yǎng)基中分別附加NAA(3.0mg/L,5.0 mg/L)、6-BA(1.5 mg/L,2.0 mg/L)、水解酪蛋白(CH)400 mg/L、蔗糖75 g/L、瓊脂6 g/L,獲得了體細(xì)胞胚,為后續(xù)研究提供了試驗(yàn)材料。2.利用同源克隆法從水曲柳基因組DNA中分離獲得目的基因SERK片段,測(cè)序分析片段長(zhǎng)為920 bp,含有2個(gè)內(nèi)含子,通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)Blast分析比對(duì)該SERK基因片段與其他物種的SERK基因具有較高的同源性。3.采用RACE技術(shù),成功的從水曲柳基因組中獲得SERK基因的cDNA全長(zhǎng)序列,測(cè)序結(jié)果表明cDNA全長(zhǎng)為2580 bp,該序列的編碼區(qū)(CDS)長(zhǎng)度為1884 bp,編碼627 a,5’端和3’端分別有122 bp和599 bp的非翻譯區(qū),獲得的SERK基因的CDS長(zhǎng)度與擬南芥(Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.)、煙草(Nicotiana tabacum L.)等模式植物的SERK同源基因核苷酸序列的同源性均在80%以上。表明已從水曲柳基因組中克隆獲得SERK基因全長(zhǎng),將該基因命名為FmSERK(GeneBank登錄號(hào):KT071544)。4.利用DNAMAN軟件和DNAClub等生物信息學(xué)軟件對(duì)FmSERK基因的蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行聚類分析,結(jié)果表明FmSERK基因編碼的氨基酸序列與其他物種的氨基酸序列比對(duì)同源性均在89%以上,表明水曲柳體胚發(fā)生相關(guān)FmSERK基因在進(jìn)化上屬于SERK同源基因中的SERK/LRR-RLK類基因家族;該基因共編碼627個(gè)氨基酸;其蛋白分子量是69.3916 KDa,理論推導(dǎo)半衰期為30h,不穩(wěn)定參數(shù)是39.06,說(shuō)明該蛋白為不穩(wěn)定蛋白;理論等電點(diǎn)5.57,脂肪族氨基酸指數(shù):96.56。對(duì)FmSERK氨基酸組成及理化性質(zhì)分析得出該氨基酸組成中有亮氨酸Leu(L)含量最多,為13.9%;Gly(G)和Pro(P)次之,為7.2%、7.0%;沒(méi)有檢測(cè)到吡咯賴氨酸Pyl(O)和半胱氨酸Sec(U)。該蛋白帶負(fù)電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu)數(shù)為74個(gè),其中帶正電荷殘基(Arg+Lys)總數(shù)為61個(gè)�？偟挠H水性平均系數(shù)為-0.148,預(yù)測(cè)該蛋白屬于親水性蛋白。5.利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)SERK基因在水曲柳不同器官、組織中的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,該基因在不同器官和組織中均有表達(dá),但在胚性愈傷組織中的表達(dá)量最高,非胚性愈傷組織中表達(dá)量最低,甚至不表達(dá);通過(guò)對(duì)水曲柳體胚發(fā)育不同時(shí)期SERK基因的表達(dá)量進(jìn)行分析得出:SERK基因在球形胚時(shí)期的表達(dá)量最低,隨著體胚的發(fā)育,心形胚、魚(yú)雷胚階段表達(dá)量逐漸升高,到子葉胚時(shí)期SERK基因的表達(dá)量達(dá)到最高,成熟胚時(shí)期SERK基因的表達(dá)量逐漸下降;通過(guò)對(duì)水曲柳體胚誘導(dǎo)不同時(shí)間的定量分析結(jié)果表明:培養(yǎng)初期0 d-15 d時(shí),細(xì)胞在外源激素的刺激下開(kāi)始啟動(dòng)進(jìn)行脫分化,FmSERK基因的表達(dá)量處于平穩(wěn)表達(dá)階段。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加,在培養(yǎng)20 d-30 d時(shí)SERK基因的表達(dá)量逐漸增加,當(dāng)誘導(dǎo)培養(yǎng)35 d時(shí)FmSERK基因的表達(dá)量達(dá)到最高,然后FmSERK基因的表達(dá)量開(kāi)始下降,說(shuō)明FmSERK基因?qū)λw胚不同培養(yǎng)階段細(xì)胞的表達(dá)具有調(diào)控作用,是體胚發(fā)生相關(guān)的標(biāo)記基因。
【學(xué)位單位】：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S792.41
【部分圖文】：

1.2 體胚發(fā)生相關(guān) SERK 基因克隆及其功能的研究1.2.1SERK 基因SERK（Somatic Embryogenesis Receptor-like Kinases）基因，全稱為 體細(xì)胞胚胎發(fā)生相關(guān)類受體蛋白激酶基因 ，是重要的體胚發(fā)生相關(guān)基因（Becraft，1998）。該基因?qū)儆谥参锸荏w類蛋白激酶家族中較大的家族――富亮氨酸重復(fù)序列受體類蛋白激酶LRR-RLK 亞家族（Zhang et al，1998）。目前，關(guān)于 SERK 基因的序列注冊(cè) NCBI 已接受幾十余種，這些基因加在一起組成了一個(gè)家族，就是 SERK 基因家族(Schmidt ED，1997)。SERK 基因廣泛的存在于植物體內(nèi)，在不同物種中表達(dá)方式不同，多數(shù) SERK 基因參與了體胚的發(fā)生（Thomas，2004；Somleva，2006）。SERK 基因的表達(dá)和體細(xì)胞胚胎發(fā)生關(guān)系密切，與孤雌生殖緊密相連。關(guān)于 SERK 基因的發(fā)現(xiàn)最初是在胡蘿卜下胚軸經(jīng)過(guò)懸浮培養(yǎng)獲得的胚性細(xì)胞中分離出來(lái)的，即 DcSERK。對(duì)于 SERK 基因結(jié)構(gòu)研究最清楚和最徹底的是 AtSERK1 基因（甄睿，2011）。SERK 基因的構(gòu)成是由 11 個(gè)外顯子和 10 個(gè)內(nèi)含子（如圖 1-1 所示），具有相似的內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)特征，同時(shí)外顯子與編碼蛋白功能域基本上是一一對(duì)應(yīng)（Emidio，2005）。

圖 2-1 合子胚的三種不同外植體（孔冬梅，200Fig.2-1 Three different explant of zygote (kong dongmeA 下胚軸；B 不完整胚；C 子葉A Hypocotyl; B Incomplete embryos; C Cotyledo用 MS1/2 培養(yǎng)基。激素組合分別為：6-BA2.0 mg/L+NAA5 mg/L添加水解酪蛋白（CH）400 mg/L、75 g/L 蔗胚軸接種到培養(yǎng)基上，每個(gè)處理接種 10 皿養(yǎng)初期每天觀察和統(tǒng)計(jì)外植體的污染情況立刻將未污染的外植體在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)移到行統(tǒng)計(jì)。繼代培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基與初代培養(yǎng)養(yǎng)的污染不算入外植體污染率統(tǒng)計(jì)當(dāng)中。在密封不透光紙盒箱中，再放入培養(yǎng)室中

3+6-BA1.5 未成熟合子胚胚軸 17.4 11.55+6-BA2 未成熟合子胚子葉 7.1 12.33+6-BA1.5 未成熟合子胚子葉 11.5 15.95+6-BA2 成熟合子胚胚軸 12.7 11.33+6-BA1.5 成熟合子胚胚軸 12.4 9.75+6-BA2 成熟合子胚子葉 14.3 12.13+6-BA1.5 成熟合子胚子葉 13.5 11.8本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)兩種激素組合分別對(duì)水曲柳成熟胚和未成熟胚進(jìn)行誘導(dǎo)，在對(duì)為成熟體胚誘導(dǎo)的試驗(yàn)中，愈傷組織誘導(dǎo)率最高為 17.4%，是使用 NAA3 mg/L+6-BA1/L 激素組合對(duì)胚軸進(jìn)行誘導(dǎo)，體胚誘導(dǎo)率最高為 15.9%，同樣是使用 NAA/L+6-BA1.5 mg/L 的激素組合進(jìn)行誘導(dǎo)，說(shuō)明該激素組合適合未成熟胚的愈傷組織體胚誘導(dǎo)；在對(duì)成熟胚進(jìn)行誘導(dǎo)的試驗(yàn)中，愈傷組織誘導(dǎo)率和體胚誘導(dǎo)率最高的合都為 NAA5 mg/L+6-BA2 mg/L，說(shuō)明該激素組合適合成熟胚的愈傷組織誘導(dǎo)和導(dǎo)。在誘導(dǎo)過(guò)程中會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生顏色呈黃色或半透明顆粒狀（圖 2-1）的愈傷組織還伴隨著與愈傷組織相似的組織，但該組織呈黃褐色且質(zhì)感較硬，為非胚性愈傷圖 2-2），在繼代培養(yǎng)中，逐漸褐化死亡。
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2868115