發(fā)布時間：2020-11-03 03:23

　　 OsMY1(GenBank DQ641916)基因是本實驗室前期通過酵母雙雜交篩選,從水稻雌雄蕊形成期幼穗cDNA庫中分離得到的功能未知基因。序列分析顯示,該基因cDNA編碼區(qū)的5'端不完整。本研究擬克隆該基因全長cDNA序列,并利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù),構(gòu)建OsMY1基因敲除水稻,同時以實驗室前期構(gòu)建的OsMY1基因RNAi水稻T1代為材料開展研究,旨在明確該基因在水稻生長發(fā)育中的功能。為了獲得OsMY1基因的5′端序列,采用5′-RACE結(jié)合RT-PCR技術(shù),從水稻的幼穗組織中克隆該基因全長cDNA序列。首先通過5′-RACE獲得其5'端序列,與原3′端序列拼接后,得到全長為1953bp的OsMY1基因cDNA序列,據(jù)此設(shè)計引物,通過RT-PCR擴(kuò)增其cDNA序列。測序結(jié)果顯示,OsMY1基因cDNA序列中包含一個1140bp的ORF,編碼379個氨基酸。生物信息學(xué)分析顯示,OsMY1蛋白中僅含有兩個保守的CC結(jié)構(gòu)域,屬于水稻ICR蛋白,OsMY1與短花藥野生稻的ICR序列具有90.7%的同源性。為了分析OsMY1基因在水稻中的表達(dá)模式,采用qRT-PCR技術(shù),檢測水稻不同發(fā)育階段:幼苗期(根、葉)、分蘗期(根、葉)、幼穗分化期8個階段中OsMY1基因的表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)OsMY1在幼苗期的葉比在根中的表達(dá)量高,在分蘗期的根中比在葉中表達(dá)量高,而抽穗期的幼穗中,OsMY1的表達(dá)水平明顯比其他兩個發(fā)育時期的表達(dá)水平高,其中在穎花長度3-5mm的幼穗中表達(dá)量最高。為了鑒定水稻OsMY1基因的功能,利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)構(gòu)建基因敲除水稻。通過序列比對,篩選了兩個編輯靶點,進(jìn)而構(gòu)建了CRISPR/Cas9植物表達(dá)載體。以日本晴水稻為材料,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,對水稻愈傷組織進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,并獲得再生植株。經(jīng)潮霉素抗性基因篩選及PCR靶位點分子測序檢測,證實獲得了2個純合敲除水稻株系(Cas9-OsMY1)。對Cas9-OsMY1水稻T1代進(jìn)行農(nóng)藝學(xué)性狀統(tǒng)計,結(jié)果表明,敲除水稻與對照相比,株高極顯著降低,平均減小5.3%;穗長極顯著增加,平均增加18.6%,但是在有效分蘗數(shù)、穗實粒數(shù),結(jié)實率,千粒重等農(nóng)藝學(xué)性狀上均無明顯差異。對實驗室前期構(gòu)建的OsMY1基因RNAi水稻(RNAi-OsMY1)進(jìn)行T2和T3代的連續(xù)篩選和鑒定,獲得6個OsMY1基因表達(dá)量下調(diào)的株系。對RNAi-OsMY1水稻表型觀察發(fā)現(xiàn),與對照相比,在幼苗期和生殖生長階段,RNAi水稻株高均極顯著降低。農(nóng)藝性狀統(tǒng)計表明,株高、穗長、結(jié)實率和千粒重均極顯著降低,其中株高平均減小21.25%,穗長平均降低17.1%,結(jié)實率平均降低10.5%,千粒重平均降低13.24%。為了探究OsMY1基因RNAi水稻和敲除水稻株高降低的原因,利用qRT-PCR技術(shù),檢測了赤霉素(GA)合成途徑以及信號傳遞途徑8個相關(guān)基因在葉片中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)無論在RNAi水稻還是敲除水稻中,赤霉素合成基因(OsCPS、OsKO2、OsKAO)和信號正向調(diào)控傳導(dǎo)基因(OsGID1、OsGID2)與對照相比表達(dá)量均下調(diào),而負(fù)調(diào)控信號傳導(dǎo)基因OsSLR1與對照相比表達(dá)量上調(diào)。本文基于實驗室的前期工作基礎(chǔ),通過5′-RACE結(jié)合RT-PCR技術(shù),克隆了OsMY1基因的全長cDNA序列,并通過序列比對分析,明確了該基因?qū)儆谒綢CR蛋白。分別采用RNAi和CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)對該基因開展功能鑒定,證實該基因被敲除或者表達(dá)被抑制都導(dǎo)致水稻株高降低。為解析轉(zhuǎn)基因水稻株高降低的分子機(jī)制,以GA信號通路為切入點,證明了株高降低的原因在于GA合成途徑以及信號傳遞途徑關(guān)鍵基因表達(dá)水平下調(diào),為后續(xù)深入研究OsMY1基因在水稻株高性狀控制中的功能奠定了基礎(chǔ),同時也為水稻矮化分子育種提供了新的潛在的候選基因。
【學(xué)位單位】：河南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S511;Q943.2
【部分圖文】：

而 GA3和 GA7是與 GA1和 GA4相比具有較少豐度的含雙鍵的 GAs[29]。赤霉素的生物代謝通路可分為三個步驟進(jìn)行[30-33]如圖 1-1，第一步發(fā)生在質(zhì)P 是 GAs 的前一階段的物質(zhì)，在古巴焦磷酸生成酶（ent-copalyl diphosphate sy和內(nèi)根-貝殼杉稀生成酶（ent-kaurene synthase KS）共同催化下合成內(nèi)根見t-Kaurene）；第二步在植物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上催化發(fā)生：第一步的生成物中 C19的 CH氧化，催化酶為內(nèi)根-貝殼杉烯氧化蛋白（ent-kaurene oxidase KO），先后合成杉稀醇（ent-kaurenol）、內(nèi)根-貝殼杉稀醛（ent-kaurenal）和內(nèi)根-貝殼杉t-kaurenoic acid）。第三步 C-7ɑ 通過內(nèi)根-貝殼杉烯酸氧化蛋白（ent-kaurenose KAO）三次去氫反應(yīng)合成了內(nèi)根-7ɑ-羥基貝殼杉烯酸 CA12-醛。CA12-醛進(jìn)A12/CA53；在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中生成 GA：CA12和 CA53運送至細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)后，C酶（CA20ox、CA3ox、CA2ox）氧化成對應(yīng)的有活性的 GAs[32,34-36]。

圖 1-2 植物體內(nèi) GA 信號傳導(dǎo)途徑（注：引自 Jean-Michel Davière 等[55]）水稻中與 GA 信號傳遞相關(guān)的株高基因，見附錄 A 表 A-2。早先研究的水稻變異體 d1 對 GA 不敏感，對它噴灑外源赤霉素?zé)o響應(yīng)，但內(nèi)源赤的含量高于野生型。D1 基因調(diào)控 GTP 結(jié)合蛋白的 α 亞基的生成，表明 GTP 結(jié)合蛋響赤霉素信號傳遞[56]。矮稈基因 gid1[19]和 gid2[57]、高稈基因 slr1[21]都參與赤霉素的信號傳遞。gid1(gibberellin insensitive dwarf1)是 GA 不靈敏變異體，GID1 調(diào)控可溶的 GA 結(jié)合能特異地結(jié)合有生物學(xué)效應(yīng)的 GAs[19]，有生物學(xué)效應(yīng)的 GAs 可能與 GID1 親和后夠與 SLR1 結(jié)合，變成 GID1-GA-SLR1 多聚體，SCFGID2多聚體泛素化促使了 SLR解[58-59]。gid2(gibberellin insensitive dwarf2)也是水稻 GA 不靈敏變異體，GID2 調(diào)控 SCF E體的一個 F-box 亞基的生成，它和 OsSkp15 結(jié)合變成 SCF 多聚體的一個元件；SLR

圖 1-3 油菜素內(nèi)酯的生物生成代謝途徑（注：引自 Shozo Fujioka 等[68]）中與 BR 合成相關(guān)的株高基因，見附錄 A 表 A-3。水稻 BR 缺失型變異體發(fā)現(xiàn)，給它們施加油菜素內(nèi)酯后恢復(fù)正常。 d2 是 BR 缺失型變異體，D2 調(diào)控 BR 代謝過程中的另一個主效酶（CYP90素 P450 家族 CYP90D 類[14]。 brd1 是 BR 缺失型變異體，株高矮小、葉鞘和葉片變小，且葉呈現(xiàn)卷曲；B C-6 氧化酶(OsBR6ox)的生成，是一類細(xì)胞色素 P450 蛋白，在油菜素內(nèi)酯作用[24]。 brd2 的莖稈略低，屬于中矮稈；與擬南芥的 DIM/DWF1 基因功能相近，素內(nèi)酯代謝前期的 24-亞甲基膽固醇(24-MC)到菜油甾醇(CR)的過程，變異類 BR 效應(yīng)物 DS(dolichosterone)，可能在水稻中是 BR 代謝的補充過程[25 d11 株高降低和粒長變小，D11 調(diào)控細(xì)胞色素 P450(CYP724B1)的生成，
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1 侯成千;梁衛(wèi)紅;王軍;;水稻OsMY1和OsRacD基因互作的分子鑒定[J];中國生物工程雜志;2008年07期

2 梁衛(wèi)紅;李輝;李佳佳;林群婷;王軍;侯成千;樓晨;楊丹丹;郝雨帆;王俊杰;;非生物脅迫和植物激素對與水稻OsRac5結(jié)合的含CC域蛋白編碼基因OsMY1和OsMY2表達(dá)的影響[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報;2013年04期

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1 杜京堯;水稻OsMY1基因的克隆及功能的初步鑒定[D];河南師范大學(xué);2018年

2 李輝;水稻含CC域蛋白OsMY1、OsMY2與OsRac5的相互作用及其表達(dá)特性研究[D];河南師范大學(xué);2013年

本文編號：2868021