干旱和鹽堿脅迫嚴(yán)重影響植物的生長發(fā)育。在高等植物長期進(jìn)化過程中,已經(jīng)形成了各種復(fù)雜的防御機(jī)制抵抗逆境,其中DREB類轉(zhuǎn)錄因子是植物中所特有的一類能與DRE順式作用元件特異性結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子。在非生物逆境脅迫中這類轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)節(jié)下游一系列抗逆基因的表達(dá)。因此,利用DREB轉(zhuǎn)錄因子來改良作物的抗逆性在植物遺傳育種中能獲得較為理想的綜合效果。巴哈雀稗(Paspalum notatum)作為一種推廣應(yīng)用較為廣泛的牧草,本身具有較強(qiáng)的抗逆特性,可作為研究植物抗逆機(jī)理的好材料。為挖掘巴哈雀稗抗逆基因,初步揭示其抗逆機(jī)理,本研究在克隆巴哈雀稗D(zhuǎn)REB2基因的基礎(chǔ)上,采用PEG-6000(20%)和Na Cl(300 mmol·L-1)溶液處理模擬逆境脅迫,分析該基因的時序表達(dá)和生理指標(biāo)變化情況。研究結(jié)果如下:(1)巴哈雀稗經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測序共獲得了42,844,132個序列讀取片段(reads),包含了6,426,619,800 bp(6.42 GB)的序列信息。對reads進(jìn)行序列組裝,獲得99,235個單基因簇(unigene),平均長度641.96 bp。(2)巴哈雀稗53,886個unigene在NR數(shù)據(jù)庫中可找到相似序列,相似序列匹配的近緣物種中,與谷子(Setaria italica)、高粱(Sorghum bicolor)和玉米(Zea mays)匹配度最高。經(jīng)GO、COG和KEGG功能分類注釋分析,均指出其大量unigene與信息傳導(dǎo)機(jī)制、運(yùn)輸及代謝相關(guān)。(3)采用RNA-Seq結(jié)合RT-PCR技術(shù)從巴哈雀稗中獲得一個DREB2基因,命名為Pn DREB2(Gen Bank登錄號:MH150946)。氨基酸序列分析表明,該基因開放閱讀框全長774 bp,可編碼257個氨基酸,相對分子量為28.09 k D,理論等電點(diǎn)為5.25。Pn DREB2蛋白含有DREB類基因家族典型的保守域——AP2結(jié)構(gòu)域。(4)進(jìn)化和聚類分析結(jié)果表明,巴哈雀稗D(zhuǎn)REB2基因與高粱、割手密(Saccharum spontaneum)、玉米、谷子及牛鞭草(Hemarthria compressa)親緣關(guān)系較近,氨基酸序列同源性分別為91.10%、89.50%、88.20%、87.60%和87.60%。(5)實(shí)時定量PCR分析表明,旱、鹽脅迫下Pn DREB2基因在巴哈雀稗莖中表達(dá)量最高,幼穗次之,葉最低;Pn DREB2 m RNA表達(dá)強(qiáng)烈,受干旱(PEG-6000,20%)脅迫誘導(dǎo),同時也受到高鹽(Na Cl,300 mmol·L-1)脅迫誘導(dǎo),隨脅迫時間的延長總體呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。(6)隨著PEG脅迫時間的延長,可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、POD活性、SOD活性、葉綠素a含量均表現(xiàn)為先增后降趨勢,CAT活性則呈現(xiàn)先降后增趨勢;葉綠素b與總?cè)~綠素含量呈先升后降再小幅度上升趨勢;脯氨酸和丙二醛隨脅迫時間延長含量增加。(7)隨著Na Cl脅迫時間的延長,可溶性蛋白含量表現(xiàn)為逐漸下降趨勢;脯氨酸和丙二醛含量均隨著Na Cl脅迫時間的延長而增加;其余指標(biāo)均呈先增后降的變化趨勢。(8)在Na Cl和PEG兩種脅迫下,DREB2基因相對表達(dá)量均表現(xiàn)出與抗氧化酶類呈顯著正相關(guān)關(guān)系,與總?cè)~綠素、葉綠素a、葉綠素b呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。而DREB2基因相對表達(dá)量與可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸、丙二醛之間在兩種脅迫處理下存在差異:鹽脅迫下,DREB2基因表達(dá)量與可溶性糖、可溶性蛋白呈不顯著正相關(guān),與脯氨酸、丙二醛呈負(fù)相關(guān);干旱脅迫下,DREB2基因表達(dá)量與可溶性糖、脯氨酸呈顯著正相關(guān),與丙二醛不顯著相關(guān),與可溶性蛋白呈負(fù)相關(guān)。
【學(xué)位單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S543.9
【部分圖文】：

貴州大學(xué) 2018 屆碩士學(xué)位論文的序列信息（圖 2.1）。采用 Trimmomatic 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，獲得 40,006,430 Cleareads。進(jìn)一步對序列進(jìn)行組裝，獲得 99,235 個 unigene，長度大于 500bp 的 unigen有 37,413 個，長度大于 1,000bp 的 unigene 有 18591 個，其中，最長的 unigen長度為 10 795bp，最低的 unigene 長度 201 bp，平均長度為 641.96 bp。

后依次是高粱（19.66%）、玉米（Zea mays, 12.82%）、二穗短柄草（Brachypodiumdistachyon, 6.62%）、大麥（Hordeum vulgare, 6.31%）、節(jié)節(jié)麥（Aegilops tauschii,4.39%）、水稻（Oryza sativa, 3.55%）等（圖2.2），由于缺乏巴哈雀稗的基因組、EST和蛋白序列信息，部分的unigene在數(shù)據(jù)庫中無法與已知基因進(jìn)行匹配。

圖 2.3 巴哈雀稗 unigene 的 GO 注釋分類柱狀圖Figure 2.3 Paspalum notatum GO annotation unigene's classification histogram注：橫軸為 GO 的二級分類，縱軸為該分類內(nèi)基因個數(shù)（右）及其占被注釋上基因總數(shù)的百分比（左）。Note: The horizontal axis is the secondary classification of GO, and the vertical axis is the number of genes in theclassification (right) and the percentage of the total number of genes being annotated (left).2.5.4 巴哈雀稗unigene的COG功能分類注釋將巴哈雀稗unigene與COG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，并預(yù)測其功能，然后進(jìn)行分類統(tǒng)計。結(jié)果表明，根據(jù)巴哈雀稗unigene功能，大致可分為25類（圖2.4中用A～Z表示），然后對每一類的unigene進(jìn)行詳細(xì)的分析，得知unigene包含了大多數(shù)的生命活動，涉及的COG功能類別比較全面。其中，信息傳導(dǎo)機(jī)制類基因最多（3,330個）；其次是翻譯后修飾，折疊和分子伴侶類基因（3,105個）、一般功能預(yù)測類基因（2,924個）和翻譯，核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生類基因（2,053個）；而胞外結(jié)構(gòu)類基因（77個）和核結(jié)構(gòu)類基因較少（103個），細(xì)胞運(yùn)動類基因最少（9個）。
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2866756