近年來,類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALEN)、鋅指核酸內(nèi)切酶(zinc finger endonuclease,ZFN)及成簇的規(guī)律性間隔短回文重復(fù)序列及相關(guān)核酸內(nèi)切酶(CRISPR/Cas9,Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins)等基因編輯技術(shù)得到快速發(fā)展并用于各種基因組的編輯。其中,CRISPR-Cas9技術(shù)以簡單高效的特點得到了廣泛的應(yīng)用。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建動物疾病模型在研究人類疾病致病機理和藥物篩選中有重要意義。鉀離子通道四聚化結(jié)構(gòu)域(potassium channel tetramerization domain,KCTD)蛋白基因家族是一個保守的基因家族,該家族成員的共同特征是具有一個含有BTB(Bric-a-brack,Tram-track,Broad complex)保守結(jié)構(gòu)域的N-末端和一個可變的C-末端。KCTD基因家族從無脊椎動物到脊椎動物廣泛存在,無脊椎動物線蟲中僅有5個成員,果蠅中有8個成員,而在脊椎動物小鼠和人類中有24個成員。KCTD參與的生物過程包括轉(zhuǎn)錄抑制、細胞骨架調(diào)控等,其蛋白質(zhì)在增殖、分化、凋亡、代謝中擔任重要角色。KCTD基因的突變或不正常調(diào)控與人類多種疾病相關(guān)。七鰓鰻是目前存在的最古老的脊椎動物,是聯(lián)系無脊椎動物和脊椎動物之間的橋梁,在生物進化研究中發(fā)揮無可替代的作用。與兩棲類相似,七鰓鰻生活史中也有一個像蝌蚪變成青蛙的變態(tài)過程(metamorphosis),有研究將七鰓鰻的變態(tài)過程劃分為七個階段(M1-M7)。目前,已有海七鰓鰻(Petromyzon marinus)和日本七鰓鰻(Lethenteron japonicum)2個物種的基因組被解析,這些信息對于我們研究基因和基因家族的起源和進化都具有重要的意義。本研究通過對海七鰓鰻和日本七鰓鰻基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析,全面系統(tǒng)地鑒定了海七鰓鰻和日本七鰓鰻kctd基因家族成員,并對其基因結(jié)構(gòu)特征、蛋白保守基序和基因表達模式進行了分析。在海七鰓鰻和日本七鰓鰻中分別鑒定出13和14個kctd基因,基因長度和外顯子數(shù)目在不同kctd基因間變化很大,Kctd蛋白中4個基序保守性顯著,大多數(shù)kctd基因呈泛表達模式,并且在胚胎發(fā)育時期明顯高表達。除七鰓鰻外,對12個無脊椎動物和脊椎動物代表物種kctd基因家族成員進行了鑒定,并對kctd基因家族成員的進化關(guān)系進行了分析。根據(jù)進化樹聚類情況,將kctd基因家族成員分為10個亞家族。進化分析顯示,kctd基因家族從低等的無脊椎動物線蟲和果蠅到高等的人類都存在;線蟲中僅有5個成員,果蠅中有8個成員,隨著物種進化程度由低到高,kctd家族成員數(shù)目呈現(xiàn)增加的趨勢;從爬行類開始,脊椎動物kctd基因數(shù)目穩(wěn)定在24個左右。硬骨魚類特有的全基因組復(fù)制事件影響魚類kctd基因數(shù)目。本研究結(jié)果不僅豐富了七鰓鰻kctd基因家族信息,同時也對kctd家族基因間的進化關(guān)系進行了探究,為深入研究該家族基因功能奠定了基礎(chǔ)。利用CRISPR/Cas9技術(shù)實現(xiàn)了對斑馬魚kctd基因家族中4個基因,即kctd3、kctd7、kctd8和kctd14的成功敲除,并希望能夠通過對所獲得的4個基因的純合突變體進行基因功能的初步研究。在F0時,對定點敲除的kctd3、kctd7、kctd8和kctd14進行敲除效率的統(tǒng)計,所敲除的4個基因的突變效率都在30%-90%之間。在kctd純合突變體的篩選中,符合孟德爾遺傳定律。本次斑馬魚kctd基因突變體的構(gòu)建中,獲得兩種類型kctd3純合突變體,分別為-11bp和-20bp;kctd7純合突變體為+19bp和-19bp兩種類型;以及+13bp的kctd8純合突變類型和-8bp的kctd14純合突變類型。通過半定量RT-PCR技術(shù)以β-actin作為內(nèi)參對成魚的不同組織(腮、皮膚、眼睛、卵巢/精巢、心臟、肌肉、肝臟、腎、脾和腦)和不同發(fā)育階段(1天、2天、3天、5天、10天、20天、30天、45天和60天)斑馬魚的kctd3、kctd7、kctd8和kctd14基因的時空表達模式進行初步的分析。從量化數(shù)據(jù)可以看出,kctd3和kctd7在各個組織中均表現(xiàn)出高表達,kctd8和kctd14的表達表現(xiàn)出明顯的組織特異性,kctd8在眼睛、精巢和腦中的表達水平高,kctd14在卵巢、肌肉和腎中的表達高。kctd3、kctd7、kctd8和kctd14在斑馬魚的不同發(fā)育階段的表達特點相似,均表現(xiàn)出,在第3天表達較第1天和第2天顯著升高,在第5天到第45天表達量較第1天和第2天明顯升高,但在45天之后表達量又出現(xiàn)了下降的趨勢,表現(xiàn)出特異性。這些結(jié)果對于進一步分析kctd基因的功能和了解人類KCTD基因突變導(dǎo)致的某些疾病的發(fā)病機理,對于人類疾病的預(yù)防、診斷和治療具有積極的意義。
【學(xué)位單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：Q78
【部分圖文】：

第一章引言RISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9 的作用機制簇的規(guī)律性間隔短回文重復(fù)序列及相關(guān)核酸內(nèi)切酶（CRISPR/Cas9，Clarly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins），和古細菌的免疫防御系統(tǒng)[1]。CRISPR/Cas 基因座有三部分構(gòu)成，包括RNA 基因；中間 Cas 編碼基因；3' 端由正向重復(fù)序列和間隔序列按成的 CRISPR 基因座，以及位于第一個正向重復(fù)序列上游的引導(dǎo)序列PR/Cas9 的作用機制有三個步構(gòu)成，如下圖所示（圖 1-1）。

圖 1-2 細菌中三種不同類型的 CRISPR 系統(tǒng)[2]。Fig 1-2 The diagram of three different type of CRISPR system in bacteria.CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的應(yīng)用RISPR/Cas9 系統(tǒng)相比于 ZFN 和 TALEN 更加簡單，該系統(tǒng)對靶位點進行僅需要 Cas9 核酸內(nèi)切酶和兩段 RNA 就可以。并且有研究發(fā)現(xiàn)，通過 4 個這兩段 RNA 連接起來就可以和 Cas9 形成復(fù)合物并可以在體外對特定的進行切割[15]。前，CRISPR/Cas9 的 TypeⅡ型系統(tǒng)是被應(yīng)用最廣泛的一種系統(tǒng)，此系統(tǒng)人類的細胞中、小鼠和斑馬魚中成功實現(xiàn)了基因組定點修飾[16-18]。2013 年g 和 MIT 的課題組首次報道了利用 CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)實現(xiàn)了對中的 PVALB 和 EMX1 兩個基因和小鼠細胞中的 Th 基因定點突變[18]。到現(xiàn)在為止，CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)的應(yīng)用越來越廣泛，其介導(dǎo)的基

海七鰓鰻kctd家族基因結(jié)構(gòu)示意
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前9條

1 謝騰;王升;黃蕾;王雪;康利平;郭蘭萍;;基于轉(zhuǎn)錄組的新疆紫草ERF轉(zhuǎn)錄因子家族生物信息學(xué)分析[J];中國中藥雜志;2014年24期

2 陶果;信吉閣;肖晶;劉海京;成文敏;查星琴;曾養(yǎng)志;;基因敲除技術(shù)最新研究進展及其應(yīng)用[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2013年29期

3 方銳;暢飛;孫照霖;李寧;孟慶勇;;CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組定點編輯技術(shù)[J];生物化學(xué)與生物物理進展;2013年08期

4 趙屹;谷瑞升;杜生明;;生物信息學(xué)研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢[J];醫(yī)學(xué)信息學(xué)雜志;2012年05期

5 李默;吳芬芳;劉欣;李慶偉;;新的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)——可變淋巴受體研究進展[J];免疫學(xué)雜志;2011年06期

6 陳名紅;陳毅堅;葉艷青;蘇源;李成云;;用半定量RT-PCR法分析基因表達水平的影響因素[J];貴州農(nóng)業(yè)科學(xué);2009年08期

7 黃權(quán);楊志強;;七鰓鰻資源研究進展[J];水產(chǎn)科技情報;2009年03期

8 林斌彬;張子平;王藝磊;張雅芝;;七鰓鰻遺傳多樣性與演化研究進展[J];動物學(xué)雜志;2009年01期

9 鄭偉國,郭英,常春艷;生物信息學(xué)的現(xiàn)狀與未來[J];口岸衛(wèi)生控制;2004年05期

本文編號：2865142