近年來,類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALEN)、鋅指核酸內(nèi)切酶(zinc finger endonuclease,ZFN)及成簇的規(guī)律性間隔短回文重復(fù)序列及相關(guān)核酸內(nèi)切酶(CRISPR/Cas9,Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins)等基因編輯技術(shù)得到快速發(fā)展并用于各種基因組的編輯。其中,CRISPR-Cas9技術(shù)以簡單高效的特點得到了廣泛的應(yīng)用。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建動物疾病模型在研究人類疾病致病機(jī)理和藥物篩選中有重要意義。鉀離子通道四聚化結(jié)構(gòu)域(potassium channel tetramerization domain,KCTD)蛋白基因家族是一個保守的基因家族,該家族成員的共同特征是具有一個含有BTB(Bric-a-brack,Tram-track,Broad complex)保守結(jié)構(gòu)域的N-末端和一個可變的C-末端。KCTD基因家族從無脊椎動物到脊椎動物廣泛存在,無脊椎動物線蟲中僅有5個成員,果蠅中有8個成員,而在脊椎動物小鼠和人類中有24個成員。KCTD參與的生物過程包括轉(zhuǎn)錄抑制、細(xì)胞骨架調(diào)控等,其蛋白質(zhì)在增殖、分化、凋亡、代謝中擔(dān)任重要角色。KCTD基因的突變或不正常調(diào)控與人類多種疾病相關(guān)。七鰓鰻是目前存在的最古老的脊椎動物,是聯(lián)系無脊椎動物和脊椎動物之間的橋梁,在生物進(jìn)化研究中發(fā)揮無可替代的作用。與兩棲類相似,七鰓鰻生活史中也有一個像蝌蚪變成青蛙的變態(tài)過程(metamorphosis),有研究將七鰓鰻的變態(tài)過程劃分為七個階段(M1-M7)。目前,已有海七鰓鰻(Petromyzon marinus)和日本七鰓鰻(Lethenteron japonicum)2個物種的基因組被解析,這些信息對于我們研究基因和基因家族的起源和進(jìn)化都具有重要的意義。本研究通過對海七鰓鰻和日本七鰓鰻基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析,全面系統(tǒng)地鑒定了海七鰓鰻和日本七鰓鰻kctd基因家族成員,并對其基因結(jié)構(gòu)特征、蛋白保守基序和基因表達(dá)模式進(jìn)行了分析。在海七鰓鰻和日本七鰓鰻中分別鑒定出13和14個kctd基因,基因長度和外顯子數(shù)目在不同kctd基因間變化很大,Kctd蛋白中4個基序保守性顯著,大多數(shù)kctd基因呈泛表達(dá)模式,并且在胚胎發(fā)育時期明顯高表達(dá)。除七鰓鰻外,對12個無脊椎動物和脊椎動物代表物種kctd基因家族成員進(jìn)行了鑒定,并對kctd基因家族成員的進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了分析。根據(jù)進(jìn)化樹聚類情況,將kctd基因家族成員分為10個亞家族。進(jìn)化分析顯示,kctd基因家族從低等的無脊椎動物線蟲和果蠅到高等的人類都存在;線蟲中僅有5個成員,果蠅中有8個成員,隨著物種進(jìn)化程度由低到高,kctd家族成員數(shù)目呈現(xiàn)增加的趨勢;從爬行類開始,脊椎動物kctd基因數(shù)目穩(wěn)定在24個左右。硬骨魚類特有的全基因組復(fù)制事件影響魚類kctd基因數(shù)目。本研究結(jié)果不僅豐富了七鰓鰻kctd基因家族信息,同時也對kctd家族基因間的進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了探究,為深入研究該家族基因功能奠定了基礎(chǔ)。利用CRISPR/Cas9技術(shù)實現(xiàn)了對斑馬魚kctd基因家族中4個基因,即kctd3、kctd7、kctd8和kctd14的成功敲除,并希望能夠通過對所獲得的4個基因的純合突變體進(jìn)行基因功能的初步研究。在F0時,對定點敲除的kctd3、kctd7、kctd8和kctd14進(jìn)行敲除效率的統(tǒng)計,所敲除的4個基因的突變效率都在30%-90%之間。在kctd純合突變體的篩選中,符合孟德爾遺傳定律。本次斑馬魚kctd基因突變體的構(gòu)建中,獲得兩種類型kctd3純合突變體,分別為-11bp和-20bp;kctd7純合突變體為+19bp和-19bp兩種類型;以及+13bp的kctd8純合突變類型和-8bp的kctd14純合突變類型。通過半定量RT-PCR技術(shù)以β-actin作為內(nèi)參對成魚的不同組織(腮、皮膚、眼睛、卵巢/精巢、心臟、肌肉、肝臟、腎、脾和腦)和不同發(fā)育階段(1天、2天、3天、5天、10天、20天、30天、45天和60天)斑馬魚的kctd3、kctd7、kctd8和kctd14基因的時空表達(dá)模式進(jìn)行初步的分析。從量化數(shù)據(jù)可以看出,kctd3和kctd7在各個組織中均表現(xiàn)出高表達(dá),kctd8和kctd14的表達(dá)表現(xiàn)出明顯的組織特異性,kctd8在眼睛、精巢和腦中的表達(dá)水平高,kctd14在卵巢、肌肉和腎中的表達(dá)高。kctd3、kctd7、kctd8和kctd14在斑馬魚的不同發(fā)育階段的表達(dá)特點相似,均表現(xiàn)出,在第3天表達(dá)較第1天和第2天顯著升高,在第5天到第45天表達(dá)量較第1天和第2天明顯升高,但在45天之后表達(dá)量又出現(xiàn)了下降的趨勢,表現(xiàn)出特異性。這些結(jié)果對于進(jìn)一步分析kctd基因的功能和了解人類KCTD基因突變導(dǎo)致的某些疾病的發(fā)病機(jī)理,對于人類疾病的預(yù)防、診斷和治療具有積極的意義。
【學(xué)位單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：Q78
【部分圖文】：

第一章引言RISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9 的作用機(jī)制簇的規(guī)律性間隔短回文重復(fù)序列及相關(guān)核酸內(nèi)切酶（CRISPR/Cas9，Clarly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins），和古細(xì)菌的免疫防御系統(tǒng)[1]。CRISPR/Cas 基因座有三部分構(gòu)成，包括RNA 基因；中間 Cas 編碼基因；3' 端由正向重復(fù)序列和間隔序列按成的 CRISPR 基因座，以及位于第一個正向重復(fù)序列上游的引導(dǎo)序列PR/Cas9 的作用機(jī)制有三個步構(gòu)成，如下圖所示（圖 1-1）。

圖 1-2 細(xì)菌中三種不同類型的 CRISPR 系統(tǒng)[2]。Fig 1-2 The diagram of three different type of CRISPR system in bacteria.CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的應(yīng)用RISPR/Cas9 系統(tǒng)相比于 ZFN 和 TALEN 更加簡單，該系統(tǒng)對靶位點進(jìn)行僅需要 Cas9 核酸內(nèi)切酶和兩段 RNA 就可以。并且有研究發(fā)現(xiàn)，通過 4 個這兩段 RNA 連接起來就可以和 Cas9 形成復(fù)合物并可以在體外對特定的進(jìn)行切割[15]。前，CRISPR/Cas9 的 TypeⅡ型系統(tǒng)是被應(yīng)用最廣泛的一種系統(tǒng)，此系統(tǒng)人類的細(xì)胞中、小鼠和斑馬魚中成功實現(xiàn)了基因組定點修飾[16-18]。2013 年g 和 MIT 的課題組首次報道了利用 CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)實現(xiàn)了對中的 PVALB 和 EMX1 兩個基因和小鼠細(xì)胞中的 Th 基因定點突變[18]。到現(xiàn)在為止，CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)的應(yīng)用越來越廣泛，其介導(dǎo)的基

海七鰓鰻kctd家族基因結(jié)構(gòu)示意
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2865142