發(fā)布時(shí)間：2020-11-01 02:15

　　 目的:利用生物信息學(xué)方法和分子遺傳學(xué)技術(shù)探討NLRP3基因rs10754558位點(diǎn)和CARD8基因rs2043211位點(diǎn)多態(tài)性與山東青島地區(qū)漢族男性人群下肢動脈硬化閉塞癥(ASO)的關(guān)系。方法:選取758個(gè)山東青島地區(qū)漢族男性下肢動脈硬化閉塞癥患者以及793個(gè)與其相匹配的男性對照作為研究對象,用Taqman(?)探針熒光定量PCR方法將研究對象的NLRP3基因rs10754558位點(diǎn)和CARD8基因rs2043211位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。采用ELISA試劑盒測定所有研究對象血清中IL-1β濃度,應(yīng)用方差分析比較不同基因型和基因型組合IL-1β濃度的差異性。采用Quantol.2.4軟件評估統(tǒng)計(jì)功效。以SPSS20.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總、統(tǒng)計(jì)、比較和分析。采用Hardy-Weinberg遺傳平衡原則檢驗(yàn)下肢動脈硬化閉塞癥組和對照組的遺傳平衡性,以保證研究樣本的群體代表性。應(yīng)用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較下肢動脈硬化閉塞癥組和對照組的臨床資料以及血生化指標(biāo);各位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率分布情況以計(jì)數(shù)資料表示,并以x 2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;應(yīng)用方差分析法分析病例組中下肢動脈硬化閉塞癥易感基因的基因型-表型相關(guān)性;應(yīng)用比值比(OR值)及其95%可信區(qū)間(95%CI)表示相對危險(xiǎn)度;應(yīng)用Logistic回歸來分析基因-基因相互作用。以P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:(1)經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn),病例組和對照組NLRP3基因rs 10754558位點(diǎn)和CARD8基因rs2043211位點(diǎn)的各基因型分布頻率均符合遺傳學(xué)平衡(P0.05),具有群體代表性。(2)ASO組NLRP3基因rs10754558位點(diǎn)CC、CG、GG基因型分布頻率分別為32.32%、50.00%和17.68%,與對照組相對應(yīng)的三個(gè)基因型分布頻率(38.84%、47.67%和13.49%)之間相比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。兩組間C、G等位基因頻率(ASO組57.32%、42.68%,對照組62.67%、37.33%)相比較,差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。攜帶GG基因型的個(gè)體患ASO的風(fēng)險(xiǎn)明顯增高,為CC基因型個(gè)體的1.574倍(OR=1.574,95%CI 1.161-2.135,P=0.003);攜帶G等位基因的個(gè)體患ASO的風(fēng)險(xiǎn)增高,為C等位基因個(gè)體的 1.250 倍(OR=1.250,95%CI 1.083-1.444,P=0.002)。應(yīng)用 Logistic 回歸分析方法校正了吸煙指數(shù)、總膽固醇、低密度脂蛋白、空腹血糖、收縮壓和體重指數(shù)后發(fā)現(xiàn),攜帶GG基因型的個(gè)體患ASO的風(fēng)險(xiǎn)仍較高,為CC基因型個(gè)體的1.448倍(OR=1.448,95%CI 1.046-1.461,P=0.004);攜帶G等位基因的個(gè)體患ASO的風(fēng)險(xiǎn)也仍較高,為攜帶 C 等位基因個(gè)體的 1.193 倍(OR=1.193,95%CI 1.032-1.358,P=0.003)。(3)ASO組CARD8基因rs2043211位點(diǎn)AA、AT、TT基因型分布頻率分別為25.20%、48.94%和25.86%,與對照組相對應(yīng)的三個(gè)基因型分布頻率(31.400%、47.04%和21.56%)之間相比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。兩組間A、T等位基因頻率(ASO組49.67%、50.33%,對照組54.92%、45.08%)相比較,差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。攜帶TT基因型的個(gè)體患ASO的風(fēng)險(xiǎn)明顯增高,為AA基因型個(gè)體的1.494倍(OR=1.494,95%CI 1.131-1.974,P=0.005);攜帶T等位基因的個(gè)體患ASO的風(fēng)險(xiǎn)增高,為A等位基因個(gè)體的 1.234倍(OR=1.234,95%CI 1.072-1.421,P=0.003)。應(yīng)用 Logistic 回歸分析方法校正了吸煙指數(shù)、總膽固醇、低密度脂蛋白、空腹血糖、收縮壓和體重指數(shù)后發(fā)現(xiàn),攜帶TT基因型的個(gè)體患ASO的風(fēng)險(xiǎn)更高,為AA基因型個(gè)體的1.525倍(OR=1.525,95%CI 1.158-2.009,P=0.003);攜帶T等位基因的個(gè)體患ASO的風(fēng)險(xiǎn)也更高,為攜帶A 等位基因個(gè)體的 1.252 倍(OR=1.252,95%CI 1.088-1.443,P=0.002)。(4)應(yīng)用方差分析對NLRP3基因rs10754558位點(diǎn)進(jìn)行下肢動脈硬化閉塞癥易感基因的基因型-表型相關(guān)性分析,結(jié)果見表2.4。NLRP3基因rs10754558位點(diǎn)攜帶CC型、CG型、GG型基因的樣本進(jìn)行組間比較時(shí)甘油三酯(P=0.019)、膽固醇(P=0.031)、IL-1β(P=0.011)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。各基因型之間其他生化指標(biāo)和既往合并癥(高脂血癥、糖尿病、高血壓、缺血性心臟病)比例以及吸煙指數(shù)差異并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(5)應(yīng)用方差分析對CARD8基因rs2043211位點(diǎn)進(jìn)行下肢動脈硬化閉塞癥易感基因的基因型-表型相關(guān)性分析,結(jié)果見表2.5。CARD8基因rs204321 1位點(diǎn)攜帶AA型、AT型、TT型基因的樣本進(jìn)行組間比較時(shí),LDL(P=0.037)、IL-1β(P=0.014)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。各基因型之間其他生化指標(biāo)和既往合并癥(高脂血癥、糖尿病、高血壓、缺血性心臟病)比例以及吸煙指數(shù)差異也沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(6)為進(jìn)一步研究NLRP3基因rs10754558位點(diǎn)和CARD8基因rs2043211位點(diǎn)多態(tài)性影響下肢動脈硬化閉塞癥發(fā)病的病理生理機(jī)制,我們應(yīng)用ELISA試劑盒檢測了所有樣本的血清IL-1β濃度。檢測結(jié)果顯示,下肢動脈硬化閉塞癥組IL-1β濃度比對照組IL-1 β濃度明顯增高(8.21 ± 1.23ng/L vs.4.97 ±1.07ng/L,P=0.009,圖 2.7)。NLRP3 基因 rs10754558 位點(diǎn),對照組中 GG 基因型(n=107)IL-1 β 濃度高于 CC 基因型(n=308)(5.21 ± 1.03ng/L vs.3.57 ±1.11ng/L,P=0.004,圖2.8);下肢動脈硬化閉塞癥組中GG型(n=134)IL-1 β濃度也比 CC 型(n=245)明顯增高(8.41±1.01ng/L vs.6.97±1.06ng/L,P=0.003,圖2.9)。而CARD8基因rs2043211位點(diǎn),對照組中TT型(n=171)IL-1β濃度比AA型(n=249)增高(5.08±1.43ng/Lvs.4.42±1.35ng/L,P=0.004,圖2.10);下肢動脈硬化閉塞癥組中TT型(n=196)IL-1β濃度比AA基因型(n=191)明顯增高(8.75±1.06ng/L vs 7.94±0.93ng/L,P=0.019,圖2.11);下肢動脈硬化閉塞癥組中GG/TT基因型組合(n=38)IL-1β濃度比CC/AA基因型組合(n=65)明顯增高(9.24±1.24ng/L vs.6.65±1.19ng/L,P=0.009,圖2.12)。(7)采用Logistic回歸來分析兩組研究對象各基因型組合兩個(gè)基因之間在ASO遺傳易感性方面是否存在交互作用,在校正了體重指數(shù)、收縮壓、空腹血糖、低密度脂蛋白、總膽固醇和吸煙指數(shù)等指標(biāo)后,χ2=14.114,P=0.038;但是把IL-1β濃度加入校正因素后,χ2=3.812,P=0.114,這表明不同基因型組合兩個(gè)基因在ASO遺傳易感性方面存在交互作用,這種交互作用不受體重指數(shù)、收縮壓、空腹血糖、低密度脂蛋白、總膽固醇和吸煙指數(shù)等指標(biāo)影響,但是與IL-1β濃度的差異一致。結(jié)論:山東青島地區(qū)漢族男性人群中NLRP3基因r s 10754558位點(diǎn)多態(tài)性和CARD8基因r s 2 04 3 211位點(diǎn)多態(tài)性與下肢動脈硬化閉塞癥遺傳易感性密切相關(guān);在該研究人群中,NLRP3基因rs10754558位點(diǎn)GG基因型和CARD8基因rs2043211位點(diǎn)TT基因型與下肢動脈硬化閉塞癥遺傳易感性相關(guān);這兩個(gè)基因位點(diǎn)之間可以互相作用,通過影響IL-1β的產(chǎn)生和活化來促進(jìn)ASO的發(fā)生發(fā)展。本研究為ASO的發(fā)病機(jī)制提供了新的見解,并為ASO的治療和預(yù)防提供了新的潛在分子靶點(diǎn)。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R543.5
【部分圖文】：

（ＮＡＣＨＴ－ＬＲＲ－ＰＹＤ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ?ｐｒｏｔｅｉｎｓ）炎性體、ＮＬＲＰ３?炎性體和黑素瘤缺乏因??子２?（ａｂｓｅｎｔ?ｉｎ?ｍｅｌａｎｏｍａ?２，?Ａ１Ｍ２）炎性體等１５１）】（不同的炎性體復(fù)合體結(jié)構(gòu)示??意圖見圖２?）?＾?ＮＬＲＰ３?（也叫ｃｒｙｏｐｙｒｉｎ或縮寫為ＮＡＬＰ３）炎性體作為一個(gè)“分子平??臺”，由ＮＬＲＰ３蛋白、凋亡相關(guān)微粒蛋白ＡＳＣ以及ｃａｓｐａｓｅ－１酶構(gòu)成Ｃ圖３）ｔ５１】??ＮＬＲＰ３炎性體的激活途徑有三條：①鉀離子外流；②溶酶體的破裂；③活性氧族??的產(chǎn)生。［２５＿２８＇５２］該炎性體被激活后可使其中的ｃａｓｐａｓｅ－１酶活化，將ＩＬ－１?３前體??修飾成有生物活性的ＩＬ－１Ｐ，這表明ＮＬＲＰ３炎性體作為免疫反應(yīng)的重要一環(huán)對??ＩＬ－１?３的活化非常關(guān)鍵丨５３】。而ＩＬ－１?３己被證實(shí)有確切的致ＡＳ效應(yīng)，因此ＮＬＲＰ３??炎性體與ＡＳ的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，它通過ＩＬ－１０介導(dǎo)參與了?ＡＳ的炎性反應(yīng)過??程（圖４）。??Ｐｒｏ－ｃａｓｐａｓｅ－１＊５?ＮＡＩＰ２??ＮＬＲＰ１?〇?ｖ?—’?ＮＬＲＰ３?ＮＬＲＣ４?ＮＡＩＰ５?ＮＬＲＰ６?ＮＬＲＰ１２??ｉ?４０?＃?ｉ?％?ｉ?ｉ??１?１?－９１?１?１?＿??ＡＳｃｐＯ?ＡＳＣ〇５?ＡＳＣ?００?ＡＳＣ?００?ＡＳＣ?００??〇?＼?衿．??ｙ?ａ?Ｐｒｏ－ｃａｓｐａｓｅ－１?０?０?０??Ｐｒｏ＊?ｃａｓｐａｓｅ－１??Ｐｒｏ－ｃａｓｐａｓｅ－１?Ｐｒｏ－ｃａｓｐａｓｅ－１?Ｐｒｏ?ｃａｓｐａｓｅ－１?Ｐｒｏ－ｃａｓｐ

子２?（ａｂｓｅｎｔ?ｉｎ?ｍｅｌａｎｏｍａ?２，?Ａ１Ｍ２）炎性體等１５１）】（不同的炎性體復(fù)合體結(jié)構(gòu)示??意圖見圖２?）?＾?ＮＬＲＰ３?（也叫ｃｒｙｏｐｙｒｉｎ或縮寫為ＮＡＬＰ３）炎性體作為一個(gè)“分子平??臺”，由ＮＬＲＰ３蛋白、凋亡相關(guān)微粒蛋白ＡＳＣ以及ｃａｓｐａｓｅ－１酶構(gòu)成Ｃ圖３）ｔ５１】??ＮＬＲＰ３炎性體的激活途徑有三條：①鉀離子外流；②溶酶體的破裂；③活性氧族??的產(chǎn)生。［２５＿２８＇５２］該炎性體被激活后可使其中的ｃａｓｐａｓｅ－１酶活化，將ＩＬ－１?３前體??修飾成有生物活性的ＩＬ－１Ｐ，這表明ＮＬＲＰ３炎性體作為免疫反應(yīng)的重要一環(huán)對??ＩＬ－１?３的活化非常關(guān)鍵丨５３】。而ＩＬ－１?３己被證實(shí)有確切的致ＡＳ效應(yīng)，因此ＮＬＲＰ３??炎性體與ＡＳ的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，它通過ＩＬ－１０介導(dǎo)參與了?ＡＳ的炎性反應(yīng)過??程（圖４）。??Ｐｒｏ－ｃａｓｐａｓｅ－１＊５?ＮＡＩＰ２??ＮＬＲＰ１?〇?ｖ?—’?ＮＬＲＰ３?ＮＬＲＣ４?ＮＡＩＰ５?ＮＬＲＰ６?ＮＬＲＰ１２??ｉ?４０?＃?ｉ?％?ｉ?ｉ??１?１?－９１?１?１?＿??ＡＳｃｐＯ?ＡＳＣ〇５?ＡＳＣ?００?ＡＳＣ?００?ＡＳＣ?００??〇?＼?衿．??ｙ?ａ?Ｐｒｏ－ｃａｓｐａｓｅ－１?０?０?０??Ｐｒｏ＊?ｃａｓｐａｓｅ－１??Ｐｒｏ－ｃａｓｐａｓｅ－１?Ｐｒｏ－ｃａｓｐａｓｅ－１?Ｐｒｏ?ｃａｓｐａｓｅ－１?Ｐｒｏ－ｃａｓｐａｓｅ－１??圖２示：ＮＬＲＰ１、ＮＬＲＰ３和黑素瘤缺乏因子２?（ＡＩＭ２〉炎性體等的結(jié)構(gòu)示意圖??１５??

示激活NLRP3炎性體的三條途徑:①鉀離子外流②溶酶體的破裂.例如膽固醉結(jié)晶被巨噬細(xì)胞吞噬后導(dǎo)致溶酶體破裂l直)活性氧族的產(chǎn)生、X54-5}/
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 Firas Ghanem;Deepthi Vodnala;Jagadeesh K.Kalavakunta;Sridevi Durga;Noah Thormeier;Prem Subramaniyam;Scott Abela;George S.Abela;;Cholesterol crystal embolization following plaque rupture:a systemic disease with unusual features[J];The Journal of Biomedical Research;2017年02期

2 ;下肢動脈硬化閉塞癥診治指南[J];中華普通外科學(xué)文獻(xiàn)(電子版);2016年01期

3 ;下肢動脈硬化閉塞癥診治指南[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2015年24期

本文編號：2864875