TGF-β(transforming growth factors-β,轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β)在腫瘤的發(fā)生以及發(fā)展過程中的作用極其復(fù)雜。體細(xì)胞基因突變所導(dǎo)致的對(duì)TGF-β的抑制增殖作用的破壞,是惡性腫瘤形成的關(guān)鍵因素。隨之而來的是,這種對(duì)于TGF-β抑制增殖作用的脫敏,常常導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞以及被招募到腫瘤微環(huán)境的正常細(xì)胞大量表達(dá)TGF-β細(xì)胞因子。有研究表明,在腫瘤微環(huán)境下一定濃度的TGF-β細(xì)胞因子會(huì)促進(jìn)腫瘤生長以及轉(zhuǎn)移的發(fā)生。因此,選擇性抑制腫瘤細(xì)胞周圍的表達(dá)上調(diào)的TGF-β,逐漸成為治療TGF-β相關(guān)疾病的熱門治療策略。大量實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明,在小鼠移植瘤模型中,使用靶向TGF-β的特異性抗體藥物、可溶性受體以及針對(duì)TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的小分子抑制劑可有效抑制腫瘤生長。在本研究中,我們基于已經(jīng)披露部分信息的兩個(gè)抗體:一個(gè)是RD公司的雜交瘤來源的1D11工具抗體;另一個(gè)是Eli Lilly公司的LY-2382770人源化抗體,來開發(fā)出具有獨(dú)立知識(shí)產(chǎn)權(quán)的能有效結(jié)合hTGF-β1的單抗藥物先導(dǎo)分子,驗(yàn)證它的抗腫瘤效果,并最終用于下一步與PD-1單抗組建雙功能抗體或聯(lián)合用藥。在比較兩個(gè)抗體的生物活性以及理化特性之后,我們發(fā)現(xiàn)1D11抗體的親和力以及生物學(xué)活性均顯著低于LY-2382770抗體,而且兩者結(jié)合的抗原表位近似,但后者卻存在熱力學(xué)穩(wěn)定性方面的不足。在綜合考慮各方面因素以后,我們選擇Eli Lilly公司的LY-2382770抗體作為抗體工程改造的優(yōu)選分子。其次,考慮到抗體的Vh(重鏈可變區(qū))基因在抗原識(shí)別的特異性方面占據(jù)主導(dǎo)作用,為了降低改造單抗對(duì)于TGF-β抗原的特異性識(shí)別能力的削弱,并且同時(shí)進(jìn)行熱穩(wěn)定性改造,我們只對(duì)LY-2382770單抗進(jìn)行輕鏈替換,并借此尋找熱穩(wěn)定性提高的突變體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,使用輕鏈替換能有效的提高抗體的熱穩(wěn)定性以及表達(dá)量,改善抗體的聚集情況,并且對(duì)抗體自身的親和力不會(huì)產(chǎn)生明顯的影響。配合使用親和力成熟的方法可以彌補(bǔ)親和力的降低,聯(lián)合使用這兩種方法可以加速先導(dǎo)分子的研發(fā)速度和研發(fā)效率。
【學(xué)位單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R73-36
【部分圖文】：

2.4.2 懸浮 HEK293F 細(xì)胞瞬轉(zhuǎn)表達(dá)抗體蛋白的純化與鑒定我們使用轉(zhuǎn)染試劑 PEI（cationic polymer polyethylenimine）在 HEK293F 細(xì)胞中瞬轉(zhuǎn)表達(dá)抗體 1D11 和 LY2382770，二氧化碳搖床中培養(yǎng) 7 天左右，當(dāng)細(xì)胞的存活率達(dá)到 60%以下時(shí)，分兩次離心，收集最終的上清液。在蛋白質(zhì)層析純化系統(tǒng) AKTAPurifier 25 中，使用 ProteinA 親和層析柱進(jìn)行抗體的純化工作。經(jīng)過還原與非還原 SDS-PAGE 蛋白電泳之后，在還原狀態(tài)下，一共出現(xiàn)兩條帶，一條為抗體重鏈，分子量為 50KD；另一條 25KD 的帶為抗體輕鏈。在非還原狀態(tài)下，我們發(fā)現(xiàn) LY-2382770 抗體相比于 1D11 抗體有更多的聚集以及降解情圖 1 LY-2382770 和 1D11 抗 體 質(zhì) 粒 的 酶 切 驗(yàn) 證 。 1 、 3 分 別 為pCAT1.0/LY-2382770/Hc,pCAT2.0/LY-2382770/Lc 。 5 、 7 分 別 為pCAT1.0/1D11/Hc,pCAT2.0/1D11/Lc。2、4、6、8 為 Hind III 和 EcoR I 的酶切質(zhì)粒。注：Hc，抗體重鏈。Lc，抗體輕鏈

2.4.3 HPLC-SEC 檢測(cè)抗體的聚集以及降解情況我們使用 Thermo MabPac SEC-1（7.8*300mm）分子篩柱子，來檢測(cè) 1D11和 LY2382770 兩個(gè)抗體的聚集以及降解情況。工作原理：分析物分子量越大的出峰時(shí)間越早，或者說滯留時(shí)間越短；分子量越小的出峰越晚，或者說滯留時(shí)間越長；而完整抗體單體的出峰時(shí)間大約在 6.5~6.8min 之間。HPLC-SEC 的檢測(cè)結(jié)果顯示 LY-2382770 抗體成分復(fù)雜，單體的有效積分面積約占總體的72.9604%，而 1D11 抗體單體的有效積分面積約占總體的 91.1021%。相比于 1D11抗體，LY-2382770 抗體的聚集以及降解情況更為嚴(yán)重，并且與 SDS-PAGE 的結(jié)圖 2 LY-2382770 和 1D11 抗體純化 SDS-PAGE 膠圖。 native 和 denatured 狀態(tài)下，檢測(cè) LY-2382770 和 1D11 抗體的聚集情況。1、2 分別為 LY-2382770 抗體的非還原與還原狀態(tài)膠圖，3、4 分別為 1D11 抗體的非還原與還原狀態(tài)膠圖。注：native，非還原。denatured，非還原。

312.4.4 DSC 差示掃描量熱法檢測(cè)抗體熱穩(wěn)定性從 20°C 到 110°C，以恒定的加熱速度 1°C /min 進(jìn)行掃描，隨著抗體去折疊，抗體樣品吸收熱量，而消除樣品池溫差所需要的補(bǔ)充能量則通過 DSC 設(shè)備記錄下來。這些記錄就形成了我們所見到的熱力學(xué)曲線，當(dāng) 50%的抗體發(fā)生去折疊圖 3 基于 HPLC-SEC 檢測(cè)抗體單體成分。（A）LY-2382770 抗體的 SEC 峰圖，LY-2382770 抗體成分復(fù)雜，單體只占 72.9604%。（B）1D11 抗體單體成分約占91.1021%。
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