【目的】研究成熟期庫爾勒香梨粗皮果和正常果的石細(xì)胞含量與POD4基因即時表達(dá)量的相關(guān)性,為改良香梨果實(shí)品質(zhì)提供分子依據(jù)�！痉椒ā恳猿墒炱趲鞝柪障憷娲制す驼９麨樵嚥�,測定香梨果實(shí)的硬度和石細(xì)胞含量。提取香梨果肉總RNA,用qRT-PCR(Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction)方法測定POD4(peroxidase4)基因的即時表達(dá)量,分析硬度和石細(xì)胞含量與POD4基因表達(dá)的相關(guān)性。【結(jié)果】庫爾勒香梨石細(xì)胞含量在0.4~0.52 g;硬度在245.22~314.71 kg/cm~2;POD4基因在成熟果實(shí)中的即時表達(dá)量在106.89~743.29�！窘Y(jié)論】粗皮果石細(xì)胞含量是正常果的1.3倍,硬度是正常果的1.28倍,POD4基因的即時表達(dá)量是正常果的6.59倍。石細(xì)胞含量與POD4基因表達(dá)量成顯著正相關(guān)(r=0.823),與果實(shí)硬度存在正相關(guān)(r=0.783),POD4基因表達(dá)量與果實(shí)硬度存在正相關(guān)(r=0.770)。POD4基因表達(dá)差異與形成兩種表型庫爾勒香梨果實(shí)成正相關(guān)。
【部分圖文】：

確定三者之間的相關(guān)性，為今后闡述庫爾勒香梨兩種差異表型的發(fā)生機(jī)理提供候選基因。1材料與方法1．1材料1．1．1庫爾勒香梨供試材料取自新疆農(nóng)科院輪臺果樹資源圃農(nóng)戶香梨園，樹齡20年。2015年9月，樣品采摘果樹冠外圍果實(shí)100個，果實(shí)發(fā)育期150d。樣品采摘后分類:粗皮果標(biāo)準(zhǔn):選取果皮粗糙，目測果面明顯凸凹不平，果點(diǎn)粗大或萼端綠色達(dá)到果實(shí)1/3;正常果選取果面較為光滑，目測無凸凹，果點(diǎn)小，脫萼或萼端微凸的果實(shí)。果實(shí)采摘后按上述標(biāo)準(zhǔn)分組測量切塊，迅速放于液氮中冷凍處理，再放至－80℃冰箱長期保存。圖1，圖21．1．2試劑熒光定量引物POD4F和POD4Ｒ由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。ＲNAprepPurePlantKit購自天耿公司，PrimeScriptＲＲTreagentKit購自Takara公司，SyBＲPremi×ExTaqTM購自TOYOBO、CFX96TMＲeal－TimeSystem實(shí)時熒光定量PCＲ儀(美國Bio－Ｒad)，DNATaq酶購自廣東東盛生物科技有限公司。圖1粗皮果Fig．1Ｒoughskinpear圖2正常果Fig．2Normalskinpear1．2方法1．2．1粗皮果和正常果硬度和石細(xì)胞含量測定硬度:取10個果實(shí)，去皮，用BY－B型硬度計(jì)測定。石細(xì)胞含量:參照聶敬全［15］的方法進(jìn)行。稱取9個果實(shí)中部離果皮2.0mm至果心處的混合果肉35.0g，－20℃冷凍24h，在20000r/min下勻漿3min，勻漿加入水靜置，倒出上層懸浮物，重復(fù)3次，所得石細(xì)胞烘干后稱質(zhì)量，重復(fù)3次。石細(xì)胞含量=測定的石細(xì)胞干質(zhì)量/35×100。1．2．2POD4基因即時表達(dá)檢測總ＲNA的提取:參考ＲNAprepPurePlantKit進(jìn)行操作，取質(zhì)量較好的總ＲNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。cDNA的合成:參照PrimeScriptＲＲTreagentKit說明書，以100ng總ＲNA模板為起始材料，進(jìn)行cDNA第一條鏈的合成。反應(yīng)體系包括100ng總ＲNA，

正常果Fig．2Normalskinpear

胞含量和POD4基因表達(dá)量的相關(guān)性實(shí)時熒光定量PCＲ擴(kuò)增數(shù)據(jù)采用2－△△ct方法分析。△Ct(目標(biāo)基因)=Ct(目標(biāo)基因)－Ct(同一樣本actin)，△△Ct(目標(biāo)基因)=處理組△Ct(目標(biāo)基因)－對照組△Ct(目標(biāo)基因)，相對倍數(shù)=2－△△ct(目標(biāo)基因)。果實(shí)硬度和石細(xì)胞含量與POD4基因相對表達(dá)量做相關(guān)性分析。1．3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用Excel2007及SPSS17統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。2結(jié)果與分析2．1粗皮果和正常果硬度和石細(xì)胞含量研究表明，粗皮果果實(shí)硬度314.71km/cm2，正常果是245.22km/cm2，粗皮果是正常果的1.28倍。圖3粗皮果石細(xì)胞含量的平均值比正常果高30%，粗皮果每百克果肉中含石細(xì)胞0.52g，在正常果中每百克果肉中含石細(xì)胞0.4g。圖4圖3庫爾勒香梨果實(shí)硬度Fig．3FruitfirmnessofKorlafragrantpear圖4庫爾勒香梨果實(shí)石細(xì)胞含量Fig．4ThecontentofstonecellofKorlafragrantpear2．2ＲNA提取質(zhì)量檢測提取的果實(shí)ＲNA樣本，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測表明，獲得的總ＲNA均含有28S和18S兩條帶，且條帶清晰，無蛋白質(zhì)和DNA的污染，說明ＲNA樣品完整、無降解;ＲNA樣品A260/A280的值在1.95～2.00，說明樣品具有較高的純度，可滿足下一步熒光定量的要求。圖52．3POD4基因表達(dá)量利用qＲT－PCＲ技術(shù)對成熟果實(shí)進(jìn)行基因表達(dá)量檢測表明，POD4基因在成熟期香梨粗皮果果肉中表達(dá)量為743.29，正常果表達(dá)量106.89，POD4在粗皮果中表達(dá)量是正常果的6.59倍。圖62．4石細(xì)胞增量和差異基因相對表達(dá)量的相關(guān)性研究表明，石細(xì)胞含量與POD4基因表達(dá)量存在顯著正相關(guān)性，其相關(guān)系數(shù)為0.823，石細(xì)胞62
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