異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)是亞洲最受歡迎的食用魚類,鯉皰疹病毒Ⅱ型(cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)是唯一已知的鯽魚病毒病原體。I型干擾素基因在病毒核酸被宿主細胞識別時誘導,被公認為在提供針對各種生物體中的病毒的局部或全身保護中的發(fā)揮重要作用。在轉錄組分析中發(fā)現(xiàn)部分異育銀鯽基因響應CyHV-2感染的差異表達,部分干擾素轉錄物在被感染的異育銀鯽腎中顯著上調,該干擾素在本實驗中被命名為異育銀鯽IFNc(ccIFNc)。IκBα(Inhibitor of NF-κB),Rab21(Rab GTPase21)在先天免疫中起重要作用,它們被抑制消減雜交(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)證實為感染鯉皰疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)的異育銀鯽中差異表達的免疫相關基因。通過RACE技術進一步確定了異育銀鯽IFNc,IκBα,Rab21的完整ORF,IFNc的全長cDNA包含一個549 bp的開放閱讀框(ORF),編碼182個氨基酸的蛋白(GenBank登錄號BankIt2033924),異育銀鯽IκBα的全長cDNA包含一個933bp的開放閱讀框(ORF),編碼310個氨基酸的蛋白(GenBank登錄號KJ784543),Rab21的全長cDNA包含一個648 bp的開放閱讀框(ORF),編碼215個氨基酸的蛋白(GenBank登錄號KJ784545)。系統(tǒng)發(fā)育分析表明,ccIFNc與來自其他水生生物的已知I型IFN基因聚類,IκBα,Rab21顯示出與其他硬骨魚中的轉錄物高度同源。定量RT-PCR分析表明,健康異育銀鯽中,IκBα,Rab21在所檢測的所有鯽魚組織中均以低水平表達,這些基因在CyHV-2感染后6-24小時在腎中顯著上調(P0.01),數(shù)據(jù)表明IκBa,Rab21可能有潛在的抗病毒功能,IκBα和Rab21可作為宿主對CyHV-2感染免疫反應的免疫標記。健康異育銀鯽中,ccIFNc在脾,鰓,腎和肌肉中具有相對較高的表達水平。在CyHV-2的攻擊下,ccIFNc的轉錄水平在所有組織中都有明顯上調,尤其是在脾和鰓中,分別增加了436和158倍。肌肉(i.m.)注射編碼ccIFNc的真核表達質粒(pEGFP-cIFNc)觀察到ccIFNc表達明顯增加高于對照細胞15倍,CyHV-2的復制效率顯著低于對照組,過表達IFNc的異育銀鯽總體死亡率降低了30%,死亡時間有所延遲,本文研究表明,ccIFNc屬于I型干擾素家族,在對抗鯽魚CyHV-2感染方面具有潛在的作用。
【學位單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S943
【部分圖文】：

圖 2-1 基因全長 cDNA 擴增線路圖Fig2-1具體操作如下：總 RNA 提取后，按照試劑盒的說明合成 cDNA 第一條鏈(1) 在 0.5ml 微型離心管中加入下列試劑：(2) 在分別取兩個離心管加入如下試劑

圖 2-2 Rab21 的全長核苷酸序列Fig. 2-2 Full-length nucleotide sequence of Rab21DNAMAN 軟件來自不同生物體的 Rab21 氨基酸序列進行多。Rab21 通過 NJ 方法得到的所有可用的動物序列的進化樹 MEGA5 程序進行。Rab21 的進化樹分析表明其有兩個集 。異育銀鯽的 Rab21 屬于集群 I, 包括背天使（Pundamilia（Neolamprologus brichardi），斑馬宮麗魚（Maylandia z（Haplochromis burtoni）。異育銀鯽的 Rab21 和斑馬魚很

17圖 2-3 Rab21 的多序列比對(A)，3D 蛋白結構(B)和系統(tǒng)發(fā)育樹分析(C)Fig.2-3 multiple sequence alignments(A) ,3D protein structureand (B)phylogenetic tree analysis ofccIFNc(C).2.2.2 IκBα 的全長及序列分析特定的免疫相關基因的引物設計和通過 RACE-PCR 獲得 5’和 3’cDNA 全長，該基因(GenBank accession no.244 KJ784543)全長 1,388 bp.由一個 40bp 的 5’非編碼區(qū)，933bp 的開放閱讀框，和一個包含 polyA 的 413bp 的 3’非編碼區(qū)，IκBα 開放閱讀框編碼多肽含有 310 個氨基酸(aa)。高度保守的特征域被確定,IκBα 基因具有對 NF-kb 信號通路多種抑制功能，包括利用封閉核酸的遷移，DNA 的結合以及利用蛋白酶 A 磷酸化 NF-kb 蛋白。鯽魚 IκBα 基因分子水平的
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本文編號：2862297