銀鯧(Pampus argenteus)屬鱸形目鯧亞目鯧科鯧屬,為暖溫性近海中下層魚類,分布于印度洋、印度-太平洋區(qū)、朝鮮和日本西部海域,在中國沿海地區(qū)均有分布,是主要的捕撈魚種之一,屬名貴食用魚類。銀鯧這類水生變溫動(dòng)物來說,環(huán)境溫度直接影響到其生長(zhǎng)和生存,而且在實(shí)際養(yǎng)殖生產(chǎn)中,可能會(huì)因?yàn)闅夂虻淖兓蛉藶橐蛩氐仍驅(qū)е滤疁赝蛔?形成急性溫度脅迫。為應(yīng)對(duì)外界復(fù)雜多變的環(huán)境,銀鯧必須有一套高效的基因表達(dá)模式來應(yīng)對(duì)溫度的變化,從而控制生理及生化過程的正常進(jìn)行。本文首次對(duì)銀鯧肝組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,對(duì)溫度脅迫下銀鯧轉(zhuǎn)錄組的De novo拼接和基因差異表達(dá)進(jìn)行分析。本研究結(jié)果不僅對(duì)了解溫度在銀鯧基因表達(dá)中所起作用有很多幫助,還能為后人研究和人工養(yǎng)殖提供大量的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和技術(shù)資料。同工酶在魚類研究中較為廣泛,通過對(duì)組織特異性的初步分析,能夠?yàn)槠浞N質(zhì)資源、人工選育和遺傳研究提供同工酶譜和生化遺傳學(xué)的參考指標(biāo)。本文首次對(duì)銀鯧不同組織的多種同工酶的表達(dá)差異進(jìn)行研究,以期了解不同種類同工酶在各組織中所起作用。1、溫度脅迫下銀鯧轉(zhuǎn)錄組的De novo拼接和基因差異表達(dá)的分析共得到338525690條Trim Reads,序列拼接共得到3715603條Unigene;比對(duì)數(shù)據(jù)庫分析中,注釋到Nr、Nt、Swisspro庫中同源基因分別有136912條、143359條、104547條;1622071條Unigene分別注釋到GO的生物過程、分子功能和細(xì)胞組成三個(gè)子類中,KEGG分析中52121條Unigene映射到338個(gè)代謝途徑,60212條Unigene得到25個(gè)KOG分類注釋。在32℃下,6h時(shí)與對(duì)照組(27℃處理0h)對(duì)比,獲得431個(gè)差異表達(dá)基因,包括233個(gè)上調(diào)表達(dá)基因和198個(gè)下調(diào)表達(dá)基因,得到1041個(gè)GO顯著富集,KEGG顯著富集通路32個(gè);12h時(shí)獲得343個(gè)差異表達(dá)基因,包括143個(gè)上調(diào)表達(dá)基因和200下調(diào)表達(dá)基因,得到946個(gè)GO顯著富集,KEGG顯著富集通路21個(gè)。在22℃條件下,6h時(shí)與對(duì)照組對(duì)比,獲得353個(gè)差異表達(dá)基因,包括179個(gè)上調(diào)表達(dá)基因和174個(gè)下調(diào)表達(dá)基因,得到1046個(gè)GO顯著富集,KEGG顯著富集通路22個(gè);12h時(shí)獲得1303個(gè)差異表達(dá)基因,包括1111個(gè)上調(diào)表達(dá)基因和193個(gè)下調(diào)表達(dá)基因,得到1132個(gè)GO顯著富集,KEGG顯著富集通路44個(gè)。2、銀鯧RNA-seq數(shù)據(jù)中SSR標(biāo)記的信息分析銀鯧轉(zhuǎn)錄組水平上,共鑒定出107007個(gè)SSR位點(diǎn),分布在97289條unigene中,發(fā)生頻率為2.62%,SSR平均密度為476個(gè)/Mbp。在銀鯧轉(zhuǎn)錄組的SSRs中,單核苷酸與二核苷酸重復(fù)序列為主要重復(fù)類型,分別占總SSRs的48.14%和34.10%。銀鯧轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中SSR序列共包括424種重復(fù)基元類型,單核苷酸重復(fù)基元A占主要,占同一重復(fù)類型SSRs的49.57%,二核苷酸重復(fù)基元TG/AC和三核苷酸重復(fù)基元GAG/AAC是優(yōu)勢(shì)重復(fù)基元,分別占同一重復(fù)類型SSRs的42.43%和9.61%。統(tǒng)計(jì)得到重復(fù)序列長(zhǎng)度在12 bp以上的SSR標(biāo)記位點(diǎn)數(shù)占總SSR數(shù)的76.95%,具有十分豐富的多態(tài)性。3、銀鯧不同組織中4種同工酶的表達(dá)差異采用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù),分析了銀鯧(Pampus argenteus)脾臟、肝臟、肌肉、心臟、腎臟等5種組織中酯酶(EST)、乳酸脫氫酶(LDH)、谷氨酸脫氫酶(GDH)、乙醇脫氫酶(ADH)等4種同工酶的表達(dá)模式,并對(duì)各種同工酶的酶譜進(jìn)行了分析。結(jié)果表明:這4種同工酶在銀鯧5種組織中的分布均存在一定的組織特異性,其與各組織的生理機(jī)能密切相關(guān)。銀鯧4種同工酶共記錄出61條酶帶,其中EST被檢測(cè)出的酶帶數(shù)量最多也較復(fù)雜,ADH同工酶酶帶數(shù)量最少,只有6條酶帶被檢測(cè)到,LDH和GDH分別檢測(cè)到16條和9條酶帶。EST在肝和心組織中表達(dá)活性最強(qiáng),其次是肌肉組織,肝和心臟中EST條帶分布較均勻,肌肉中條帶在EST6-EST12位點(diǎn)之間分布多于EST6位點(diǎn)之前;在銀鯧肝臟組織中,共檢測(cè)到5條酶帶,活性強(qiáng)弱依據(jù)酶帶深淺為L(zhǎng)DH4LDH2LDH3LDH1LDH5,腎臟中清晰的檢測(cè)到4條酶帶,心臟中檢測(cè)到3條酶帶,肌肉和脾臟中僅檢測(cè)到兩條酶帶;銀鯧腎臟組織中檢測(cè)到3條谷氨酸脫氫酶酶帶,肝臟和心臟中檢測(cè)到2條酶帶,肌肉和脾臟組織中分別檢測(cè)到1條酶帶;銀鯧肝臟組織中檢測(cè)到2條乙醇脫氫酶酶帶,其他四種組織中僅檢測(cè)到一種類型酶帶。組織特異性主要表現(xiàn)在位點(diǎn)表達(dá)和酶活性強(qiáng)弱不同這兩個(gè)方面,比如:GDH1和ADH2只在肝臟中表達(dá),EST在肝臟和心臟組織中活躍度高于其它組織,LDH1在銀鯧肝臟組織中表達(dá)明顯。
【學(xué)位單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：S917.4
【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 引言
    1.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)簡(jiǎn)介
    1.2 溫度對(duì)魚類繁殖和生長(zhǎng)的影響
    1.3 SSR標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用進(jìn)展
    1.4 同工酶簡(jiǎn)介
    1.5 銀鯧的相關(guān)研究進(jìn)展及本研究的目的意義
第二章 溫度脅迫下銀鯧轉(zhuǎn)錄組的DE NOVO拼接和基因差異表達(dá)的分析
    2.1 材料和方法
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 銀鯧的 c DNA 序列分析與組裝
        2.2.2 銀鯧基因序列功能注釋信息
        2.2.3 熱脅迫處理實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異基因表達(dá)分析
            2.2.3.1 熱脅迫處理實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異表達(dá)基因的GO功能富集結(jié)果
            2.2.3.2 熱脅迫處理組與對(duì)照組差異表達(dá)基因的KEGG功能富集結(jié)果
        2.2.4 冷脅迫處理實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異基因表達(dá)分析
            2.2.4.1 冷脅迫處理實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異表達(dá)基因的GO功能富集結(jié)果
            2.2.4.2 冷脅迫處理實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異表達(dá)基因的KEGG功能富集結(jié)果
        2.2.5 差異表達(dá)基因?qū)哟尉垲惙治?br>    2.3 討論
第三章 基于銀鯧 RNA-seq 數(shù)據(jù)中 SSR 標(biāo)記的信息分析
    3.1 材料與方法
        3.1.1 銀鯧RNA提取及CDNA文庫構(gòu)建
        3.1.2 RNA測(cè)序及組裝
        3.1.3 銀鯧SSR標(biāo)記篩選
        3.1.4 統(tǒng)計(jì)與分析
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 銀鯧轉(zhuǎn)錄組中SSR位點(diǎn)的數(shù)量與分布信息
        3.2.2 銀鯧轉(zhuǎn)錄組SSR的特點(diǎn)
        3.2.3 銀鯧轉(zhuǎn)錄組SSR多態(tài)性評(píng)估
    3.3 討論
第四章 銀鯧不同組織中 4 種同工酶的表達(dá)差異
    4.1 材料與方法
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.2 酶液樣品制備
        4.1.3 電泳方法
        4.1.4 染色及酶譜分析
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 EST
        4.2.2 LDH
        4.2.3 GDH
        4.2.4 ADH
    4.3 討論
        4.3.1 銀鯧同工酶表達(dá)的組織特異性
        4.3.2 銀鯧不同組織同工酶表達(dá)的特異性及其與功能的關(guān)系
    4.4 小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文
致謝

【參考文獻(xiàn)】

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