背景:胃癌是源自胃黏膜上皮的惡性腫瘤。在世界癌癥相關(guān)的死亡率中,胃癌位居第三位。每年我國占全世界的42%的胃癌檢出總數(shù),達到40萬例/年,死亡人數(shù)達到30萬左右。雖然目前內(nèi)鏡技術(shù)、外科手術(shù)、放療和化療技術(shù)已經(jīng)取得了相當程度的進步,但我國中晚期胃癌病人的五年總生存率不到30%,尤其是晚期胃癌病人的預后差。因此,進一步研究胃癌發(fā)病機理中潛在的分子機制并尋找新的治療靶點顯得尤為重要。在中晚期胃癌患者中,腫瘤細胞的快速增殖可導致細胞內(nèi)的氧耗增加,瘤體內(nèi)血管結(jié)構(gòu)和功能的異常也可導致腫瘤細胞內(nèi)血液供應和氧供應減少,這都造成了腫瘤細胞的缺氧。缺氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor,HIF-1)是目前研究發(fā)現(xiàn)的在缺氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的特異性的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,HIF-1能在缺氧狀態(tài)中連接上下游基因的激活。HIF-1以異源二聚體形式廣泛存在于哺乳動物和人體內(nèi),主要由HIF-1α和HIF-1β兩個亞基組成,其中HIF-1α是活性亞基。有大量研究表明,HIF-1α過表達與胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程密切相關(guān)。同時研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達,腫瘤的分化、浸潤、轉(zhuǎn)移及分期有關(guān)。因此,HIF-1α的表達高低與胃癌的浸潤、轉(zhuǎn)移具有一定的關(guān)系,但其作用機理尚不明確。近年研究表明,HIF-1α不僅能調(diào)控多種細胞增殖、侵襲、能量代謝等相關(guān)基因,如促紅細胞生成素(EPO)編碼基因、VEGF編碼基因、內(nèi)皮素、血小板源性生長因子等,同時能夠調(diào)控細胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)、鐵代謝、線粒體代謝物、多種生長因子以及小分子核糖核酸(microRNA,mi RNA)等。mi RNA是一種長度約22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA分子,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達。通過堿基互補配對原則,mi RNA特異性結(jié)合靶基因mRNA的3′非編碼區(qū)。根據(jù)互補程度的不同,抑制靶基因的翻譯或?qū)е掳谢騧RNA降解,實現(xiàn)對轉(zhuǎn)錄后表達的調(diào)控。研究表明,miRNA在細胞的發(fā)育、凋亡、增殖和分化等生命過程中發(fā)揮重要作用。其中,miR-224被證實在肝癌中高表達,并且在黑色素瘤細胞中HIF-1α能夠促進mi R-224的表達。然而,在胃癌中,缺氧及HIF-1α是否能夠調(diào)節(jié)miR-224的表達,以及miR-224是胃癌的發(fā)生發(fā)展中所起的作用目前尚不明確。本論文通過研究缺氧及HIF-1α誘導miR-224的表達以及miR-224對胃癌細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移的作用,進一步闡明了miR-224在胃癌發(fā)生發(fā)展中的分子作用機制。目的:明確缺氧及HIF-1α誘導下的miR-224在胃癌細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移中的分子作用機制。方法:在胃癌細胞中,通過實時熒光定量PCR和Northern免疫雜交實驗對缺氧及HIF-1α誘導miR-224的表達進行了研究。使用熒光素酶報告系統(tǒng)和染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(ChIP)明確miR-224是否為HIF-1α的靶基因。再利用MTT、克隆形成實驗、體外劃痕和侵襲實驗測定miR-224在缺氧狀態(tài)下對胃癌細胞增殖、遷移和侵襲的作用,并在活體動物實驗中進行同樣的研究。利用熒光素酶報告基因系統(tǒng)和Western blot免疫印跡實驗驗證miR-224轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的目標靶基因。通過功能研究以確定在缺氧條件下RASSF8對miR-224所起的作用。并分別使用熒光素酶報告基因系統(tǒng)和Western blot免疫印跡實驗證實,RASSF8基因表達減少后,對NF-κB在轉(zhuǎn)錄活性和細胞內(nèi)分布的影響。最后,使用實時熒光定量PCR檢測miR-224和RASSF8在胃癌組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的胃癌組織中的表達水平。結(jié)果:(1)缺氧和HIF-1α能夠上調(diào)miR-224的表達。HIF-1α是在轉(zhuǎn)錄水平上影響miR-224的表達。缺氧條件下,如果抑制miR-224即可抑制胃癌細胞系的生長、遷移及侵襲,相反,如果miR-224過度表達則會促進胃癌細胞系的生長、遷移及侵襲。在動物體內(nèi)實驗中,抑制miR-224也有抑制腫瘤生長的作用。(2)確定了RASSF8基因是mi R-224的直接調(diào)控基因。過表達RASSF8能夠抑制細胞的增殖和侵襲,沉默RASSF8基因則能減弱因抑制mi R-224而被抑制的細胞增殖和侵襲。進一步發(fā)現(xiàn),沉默RASSF8,能夠增強NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性和p65質(zhì)核移位,而RASSF8過度表達則相反。使用PDTC抑制NF-κB的活性削弱敲減RASSF8在細胞增殖和侵襲方面的作用。(3)MiR-224在胃癌組織及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的胃癌組織中高表達,而RASSF8在上述組織中表達卻減少。結(jié)論:缺氧誘導下,HIF-1α能夠在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)miR-224的表達,而miR-224是通過下調(diào)RASSF8的表達來促進胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲。RASSF8通過促進p65的亞細胞再分配來促進NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。這預示著抑制miR-224可能有潛力成為胃癌治療的新靶點。
【學位單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R735.2
【部分圖文】：

圖 2.1 缺氧條件下腫瘤細胞基質(zhì)和成纖維細胞Fig. 2.1 Tumour stroma and extracellular matrix in hypoxia腫瘤導致癌癥和遠離血管的腫瘤基質(zhì)細胞的氧供應減少。缺氧導致腫瘤微環(huán)質(zhì)細胞的細胞因子表達，促進腫瘤生長。氧誘導因子（HIF-1）瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中，大多數(shù)實體腫瘤均存在永久或瞬時缺氧。件下，主要通過缺氧誘導因子（hypoxia inducible factors，HIFs）基因進而保證自身存活，如腫瘤細胞可通過激活碳酸酐酶 9 的表 值[15]；上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白 1（glucose transporter-1，GLUT-1）維持細胞內(nèi)葡萄糖的含量[16]，并通過分泌 VEGF 或激活 TAp73（traotein 73）等基因來誘導血管的形成[17][18]，這些血管在結(jié)構(gòu)上大都胞的遠處轉(zhuǎn)移提供了便利。

的活性調(diào)控區(qū)域，C 末端有一個富含脯氨酸-絲氨酸-蘇氨酸（Pro/Ser/Thr）的氧依賴降解 結(jié) 構(gòu) 域 （ oxygen-dependent degradation domain ， ODD ） 和 反 式 激 活 結(jié) 構(gòu) 域（transactivationdomain，TAD），即 TAD-C-N 末端含有 TAD-N；這些結(jié)構(gòu)域都是缺氧誘導蛋白穩(wěn)定、核定位和轉(zhuǎn)錄激活的調(diào)節(jié)域，其中 TAD-C 發(fā)揮精細調(diào)整作用，TAD-N為激活轉(zhuǎn)錄所必需，可見 HIF-1α 亞基受缺氧調(diào)控并調(diào)節(jié) HIF-1 的活性。HIF-1β 亞基又稱芳香烴受體核轉(zhuǎn)運子（aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator，ARNT），基因定位于人的 1 號染色體 q21 區(qū)，HIF-1β 除了結(jié)構(gòu)性組成作用外，其還可能與 HIF-1 在核內(nèi)的穩(wěn)定性及二聚化后的構(gòu)象轉(zhuǎn)變有關(guān)。有研究證明在 HIF-1β 亞基缺陷的細胞內(nèi)不能誘導 HIF-1 的活性，HIF-1α 亞基必須與 HIF-1β 亞基聚合形成異二聚體，才能發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用。2 個亞基的氨基端均含有堿性的螺旋-環(huán)-螺旋（basic helix-loop-helixdomain，bHLH）構(gòu)型和 Per/Amt/Sim（PAS）結(jié)構(gòu)，是其形成異源二聚體并與 DNA 結(jié)合所必需的結(jié)構(gòu)，如圖 2.2。

圖 2.3 miRNA 產(chǎn)生過程Fig2.3 miRNA production processcroRNA 的生物學特性 年，Lee 等首次發(fā)現(xiàn)了 miRNA，其通過定點突變技術(shù)在線蟲中發(fā)種小分子 RNA，而非蛋白質(zhì)，隨后，科學家們對 miRNA 展開了廣特定的組織和階段進行表達，與細胞類型和細胞分化階段相關(guān)，序性，此種特性也決定了 miRNA 在生命的生長發(fā)育的多種過程中。 miRNA 可以通過部分互補結(jié)合到目的 mRNA 靶的 3’UTR，以一質(zhì)翻譯抑制，進而抑制蛋白質(zhì)合成，通過調(diào)控一組關(guān)鍵 mRNA 的育進程[29]。
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 秦承東;任正剛;湯釗猷;;缺氧微環(huán)境在腫瘤進展中的作用[J];腫瘤;2016年01期

2 Hui-Lin Ye;Dou-Dou Li;Qing Lin;Yu Zhou;Quan-Bo Zhou;Bing Zeng;Zhi-Qiang Fu;Wen-Chao Gao;Yi-Min Liu;Rui-Wan Chen;Zhi-Hua Li;Ru-Fu Chen;;Low RASSF6 expression in pancreatic ductal adenocarcinoma is associated with poor survival[J];World Journal of Gastroenterology;2015年21期

本文編號：2860776