目的:研究T-box轉錄因子TBX20基因突變與漢族兒童先天性室間隔缺損之間的關系,從而為今后進一步的臨床研究和干預治療提供方向和參考。方法:收集2015年1月至2017年3月于山西省兒童醫(yī)院心外科住院患者中50例先天性室間隔缺損患兒為病例組,男23例,女27例;其中3例患兒有室間隔缺損家族史,采集其兄弟姐妹及父母親的靜脈血同時也進行TBX20基因檢測,其中病例組均通過體格檢查,心臟彩超及術中診斷確診為室間隔缺損。收集同時期內(nèi)山西省兒童醫(yī)院門診就診的健康兒童30例為對照組,男16例,女14例,均采集其外周靜脈血,按照生工基因組DNA抽提試劑盒說明書提取基因組DNA,采用美國PTC-200型自動擴增儀對病例組與對照組以及家系中編碼TBX20基因T-box結構域的第2~6外顯子進行聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)進行擴增,然后將PCR擴增產(chǎn)物純化后經(jīng)美國ABI公司3700DNA測序儀進行測序分析,再通過美國國家生物技術情報中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)網(wǎng)頁中BLAST程序?qū)y序結果與基因庫中人TBX20基因組對比分析,再結合基因測序圖校對結果,從而檢測突變與單核苷酸多態(tài)性,并通過統(tǒng)計學軟件SPSS 20.0對病例組與對照組以及家系中新發(fā)現(xiàn)的單核苷酸多態(tài)性位點等位基因頻率及基因型頻率進行分析比較,從而研究其基因型及等位基因是否為漢族兒童先天性室間隔缺損的發(fā)病危險因子。結果:1.在5例漢族兒童先天性室間隔缺損患兒中同時檢測到一個同義突變(T192T)和一個錯義突變(G193S),這兩種突變均位于第4外顯子區(qū)域,錯義突變G193S(c.577G/A)導致氨基酸由甘氨酸變?yōu)榻z氨酸,且這兩種突變均未在對照組中發(fā)現(xiàn),經(jīng)Mutation Taster軟件預測顯示這兩個突變都有致病性。通過NCBI網(wǎng)Homologene對TBX20基因的兩個突變位點進行檢測后發(fā)現(xiàn)這兩種突變的氨基酸在人和多種動物均具有高度保守性。2.在病例組與對照組中第5內(nèi)含子區(qū)新發(fā)現(xiàn)了2個單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP),其中一個變異位于起始密碼子ATG前61個堿基對(base pair,bp),另一個位于終止密碼子(UGA/UAA/UGA)下游142bp,且這兩個單核苷酸多態(tài)性在單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫中尚未報道。經(jīng)SPSS20.0統(tǒng)計學數(shù)據(jù)分析,位于起始密碼子ATG前61bp的位點變異(TC),經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)TC基因型頻率病例組較對照組高,差異具有統(tǒng)計學意義(χ~2=33.55,P0.05),等位基因C的頻率病例組較對照組高,差異具有統(tǒng)計學意義(χ~2=15.96,P0.05)。TC基因型OR值(OR值為26.83)大于1,且CI 95%(7.42~97.08),下限值大于1,認為TC基因型可能使?jié)h族兒童先天性室間隔缺損發(fā)病風險增加。等位基因C的OR值(OR值為4.83)大于1,等位基因T的OR值(OR值為0.21)小于1,TT基因型OR值(OR值為0.04)小于1,考慮等位基因C可能是漢族兒童先天性室間隔缺損的致病性基因,而T等位基因可能它的保護性基因。3.位于終止密碼子下游142bp的位點變異(AC)在病例組與對照組以及家系病人中均為雜合型變異,故未做統(tǒng)計學分析。4.家系中未發(fā)現(xiàn)新的突變與單核苷酸多態(tài)性,有先天性室間隔缺損家族史的患兒與其家系中未發(fā)現(xiàn)有相同的突變,本研究結果未能體現(xiàn)出患兒家系與患兒之間是否有遺傳性關系,考慮與收集標本數(shù)少有關。結論:1.第4外顯子區(qū)發(fā)現(xiàn)的同義突變(T192T)與錯義突變(G193S)可能與漢族兒童先天性心臟病室間隔缺損的發(fā)病機制相關,提示TBX20可能是室間隔缺損的致病基因。2.位于第5內(nèi)含子區(qū)即起始密碼子ATG前61bp的位點變異(TC),經(jīng)SPSS20.0統(tǒng)計學數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)TC基因型可能使?jié)h族兒童先天性室間隔缺損發(fā)病風險增加,且等位基因C可能是漢族兒童先天性室間隔缺損的致病性基因;T等位基因可能是漢族兒童先天性室間隔缺損的保護性基因。3.位于第5內(nèi)含子區(qū)即終止密碼子UGA/UAA/UGA)下游142bp的位點變異(AC)在病例組與對照組以及家系中均為雜合型變異,考慮其變異可能與漢族兒童先天性心臟病室間隔缺損的發(fā)病不相關。
【學位單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R725.4
【部分圖文】：

電泳時間為30~50min。（3）成像：電泳結束后，將凝膠置于成像分析儀紫外光下觀察結果，通過對照DNAMarker各條帶位置鑒定產(chǎn)物片段大小，凝膠成像系統(tǒng)照相保存（見圖1和圖2）。同時根據(jù)目的基因處條帶亮度和特異度等來調(diào)整PCR反應條件。圖 1：TBX20 基因第 2~6 外顯子 PCR 電泳圖1.3.3 產(chǎn)物鑒定與純化根據(jù) PCR 產(chǎn)物電泳結果切割所需 DNA 目的條帶，利用瓊脂糖切膠進行鑒定與純化。1.3.4 DNA 序列測定與分析

電泳時間為30~50min。（3）成像：電泳結束后，將凝膠置于成像分析儀紫外光下觀察結果，通過對照DNAMarker各條帶位置鑒定產(chǎn)物片段大小，凝膠成像系統(tǒng)照相保存（見圖1和圖2）。同時根據(jù)目的基因處條帶亮度和特異度等來調(diào)整PCR反應條件。圖 1：TBX20 基因第 2~6 外顯子 PCR 電泳圖1.3.3 產(chǎn)物鑒定與純化根據(jù) PCR 產(chǎn)物電泳結果切割所需 DNA 目的條帶，利用瓊脂糖切膠進行鑒定與純化。1.3.4 DNA 序列測定與分析

26號標本
【參考文獻】

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1 趙鶴;羅毅;李玉琳;張聰聰;秦廣寧;屈昕芃;;漢族散發(fā)法洛四聯(lián)癥患兒GATA6、TBX20基因的表達研究[J];心肺血管病雜志;2013年02期

本文編號：2859228