在動(dòng)植物中' DNA和組蛋白的甲基化修飾能夠調(diào)節(jié)異染色質(zhì)的形成和轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默。甲基轉(zhuǎn)移酶在催化甲基化修飾過(guò)程中需要S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)提供甲基。因此,維持動(dòng)植物細(xì)胞內(nèi)正常的SAM水平對(duì)表觀遺傳修飾的調(diào)控起著重要的作用,但其調(diào)控途徑和機(jī)理還需更加深入的研究。通過(guò)EMS誘變攜帶Pro35S::NPTⅡ(neomycin phosphotransferaseⅡ)和ProRD29A(responsive to desiccation 29 A)::LUC 的 L119 株系,篩選能夠釋放 Pro35S::NPTⅡ位點(diǎn)沉默的突變體,得到一個(gè)維持基因沉默的作用因子甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶4(methionine adenosyltransferase 4,MAT4)。本論文對(duì)其通過(guò)影響表觀遺傳修飾調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)理進(jìn)行了研究。MAT4能夠催化SAM的合成,而SAM是普遍的甲基供體,因此本論文首先對(duì)MAT4是否影響甲基化修飾進(jìn)行分析。通過(guò)亞硫酸氫鹽測(cè)序發(fā)現(xiàn),與L119相比,mat4中CHG和CHH的DNA甲基化水平明顯下降。免疫印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)mat4中組蛋白甲基化修飾H3K9me2的水平顯著降低。而進(jìn)一步的免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)mat4中H3K9me2在細(xì)胞核中異染色質(zhì)區(qū)的狀態(tài)變得松散。同時(shí)染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)mat4中一些位點(diǎn)上H3K9me2的水平下降,這些結(jié)果說(shuō)明MAT4參與維持DNA和組蛋白甲基化修飾過(guò)程。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)mat4中很多轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄被激活,而這些轉(zhuǎn)錄發(fā)生上調(diào)的轉(zhuǎn)座子的DNA甲基化水平下降,說(shuō)明MAT4通過(guò)維持DNA和組蛋白甲基化修飾參與轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默。另外,外源施加一定濃度的SAM能夠部分恢復(fù)mat4的卡那霉素敏感表型及H3K9me2的水平,說(shuō)明SAM是通過(guò)直接影響這些甲基化修飾來(lái)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的。對(duì)擬南芥中MAT4所屬家族四個(gè)成員的研究發(fā)現(xiàn),MAT4對(duì)DNA甲基化的影響起主導(dǎo)作用。利用液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定SAM水平,結(jié)果顯示,與L119相比,mat4中SAM水平下降了35%左右:而其他mat突變體中SAM水平下降程度較小。體外酶活測(cè)定發(fā)現(xiàn)MAT4的催化能力與MAT1和MAT2相當(dāng),而MAT3的活性略高一些,說(shuō)明MAT4的主導(dǎo)作用并非其活性所致。將MAT4的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)MAT1、MAT2、MAT3 CDS轉(zhuǎn)入mat4,可互補(bǔ)mat4的表型;而將MAT1、MAT2、MAT3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)MAT4 CDS轉(zhuǎn)入mat4中,獲得的轉(zhuǎn)基因植株大多數(shù)不能恢復(fù)mat4的抗卡那霉素以及萌發(fā)遲緩的表型。進(jìn)一步用不同MAT啟動(dòng)子的材料檢測(cè),發(fā)現(xiàn)用MAT4啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的MAT轉(zhuǎn)錄水平以及MAT蛋白水平的豐度最高。因此,MAT4的表達(dá)模式可能使其在調(diào)控SAM水平上發(fā)揮更為重要的作用,進(jìn)而在影響DNA和組蛋白甲基化修飾過(guò)程中起主導(dǎo)作用。遺傳分析發(fā)現(xiàn)mat1mat4雙突變體矮小敗育,而mat2mat4雙突變體是胚胎致死的。此外,通過(guò)CRISPR/Cas9敲除MAT4獲得的片段缺失突變體也是致死的,說(shuō)明MAT4在擬南芥生長(zhǎng)和胚胎發(fā)育中有重要作用。同時(shí)通過(guò)體外的Pull-Down實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)的Co-IP實(shí)驗(yàn)證明不同的MAT蛋白之間能夠相互作用,而分子篩實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)一步證明它們?cè)诖蠓肿恿康膹?fù)合體中共同存在,說(shuō)明在擬南芥中這四個(gè)MAT蛋白能夠形成多聚體發(fā)揮功能。綜合以上結(jié)果,本研究對(duì)擬南芥中一個(gè)新的維持基因沉默的作用因子MAT4進(jìn)行了功能研究,揭示了其通過(guò)維持植物細(xì)胞內(nèi)SAM濃度,調(diào)控DNA和組蛋白甲基化修飾,進(jìn)而影響一些沉默位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄的調(diào)控機(jī)理。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)于闡明植物中代謝過(guò)程與表觀遺傳修飾過(guò)程之間的相互聯(lián)系具有重要的理論意義。
【學(xué)位單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：Q943.2
【部分圖文】：

精氨酸和天冬氨酸形成ＲＤ界面介導(dǎo)兩分子ＤＮＭＴ３Ａ蛋白的互作（圖卜１Ａ）。由此形成兩個(gè)活性??位點(diǎn)，這兩個(gè)活性位點(diǎn)被８－１０ｂｐ的一個(gè)ＤＮＡ螺旋分開，ＤＮＭＴ３Ａ催化ＤＮＡ甲基化的建立，產(chǎn)生??相隔８－１０?ｂｐ的兩個(gè)甲基化的ＣＧ位點(diǎn)（圖１－１Ｃ）?（Ｊｅｌｔｓｃｈ?ａｎｄ?Ｊｕｒｋｏｗｓｋａ＾?２０１３，?２０１６）。研宄表明??ＤＮＭＴ３Ａ具有寡聚化和多聚化的潛能：即在同一條ＤＮＡ鏈上可以結(jié)合上多個(gè)相鄰的??ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ四聚體，因此可以看到在同一條ＤＮＡ鏈上存在相同間隔的ＣＧ甲基化修飾。??ＤＮＡ結(jié)合實(shí)驗(yàn)及掃描電鏡也發(fā)現(xiàn)ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ形成的多聚體可以結(jié)合多條ＤＮＡ鏈，從而??催化?ＤＮＡ?甲基化的建立（圖?１－１Ｂ，１Ｃ，?ＩＤ，?ＩＥ）?（Ｊｅｌｔｓｃｈ?ａｎｄ?Ｊｕｒｋｏｗｓｋａ，?２０１３，?２０１６）。另外?ＤＮＭＴ３Ａ??的催化活性受到自身及未發(fā)生甲基化的Ｈ３Ｋ４殘基調(diào)節(jié)。晶體結(jié)構(gòu)解析發(fā)現(xiàn)ＤＮＭＴ３Ａ的ＡＤＤ結(jié)??構(gòu)域能夠與自身的ＣＤ結(jié)構(gòu)域（ｃａｔａｌｙｔｉｃ?ｄｏｍａｉｎ）結(jié)合，從而通過(guò)阻礙其與ＤＮＡ的結(jié)合抑制ＣＤ??結(jié)構(gòu)域的催化活性。而未發(fā)生甲基化的組蛋白Ｈ３則能夠破壞ＡＤＤ－ＣＤ的結(jié)合，解除ＤＮＭＴ３Ａ??的自我抑制作用（Ｇｕｏ?ｅｔａｌ．

精氨酸和天冬氨酸形成ＲＤ界面介導(dǎo)兩分子ＤＮＭＴ３Ａ蛋白的互作（圖卜１Ａ）。由此形成兩個(gè)活性??位點(diǎn)，這兩個(gè)活性位點(diǎn)被８－１０ｂｐ的一個(gè)ＤＮＡ螺旋分開，ＤＮＭＴ３Ａ催化ＤＮＡ甲基化的建立，產(chǎn)生??相隔８－１０?ｂｐ的兩個(gè)甲基化的ＣＧ位點(diǎn)（圖１－１Ｃ）?（Ｊｅｌｔｓｃｈ?ａｎｄ?Ｊｕｒｋｏｗｓｋａ＾?２０１３，?２０１６）。研宄表明??ＤＮＭＴ３Ａ具有寡聚化和多聚化的潛能：即在同一條ＤＮＡ鏈上可以結(jié)合上多個(gè)相鄰的??ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ四聚體，因此可以看到在同一條ＤＮＡ鏈上存在相同間隔的ＣＧ甲基化修飾。??ＤＮＡ結(jié)合實(shí)驗(yàn)及掃描電鏡也發(fā)現(xiàn)ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ形成的多聚體可以結(jié)合多條ＤＮＡ鏈，從而??催化?ＤＮＡ?甲基化的建立（圖?１－１Ｂ，１Ｃ，?ＩＤ，?ＩＥ）?（Ｊｅｌｔｓｃｈ?ａｎｄ?Ｊｕｒｋｏｗｓｋａ，?２０１３，?２０１６）。另外?ＤＮＭＴ３Ａ??的催化活性受到自身及未發(fā)生甲基化的Ｈ３Ｋ４殘基調(diào)節(jié)。晶體結(jié)構(gòu)解析發(fā)現(xiàn)ＤＮＭＴ３Ａ的ＡＤＤ結(jié)??構(gòu)域能夠與自身的ＣＤ結(jié)構(gòu)域（ｃａｔａｌｙｔｉｃ?ｄｏｍａｉｎ）結(jié)合，從而通過(guò)阻礙其與ＤＮＡ的結(jié)合抑制ＣＤ??結(jié)構(gòu)域的催化活性。而未發(fā)生甲基化的組蛋白Ｈ３則能夠破壞ＡＤＤ－ＣＤ的結(jié)合，解除ＤＮＭＴ３Ａ??的自我抑制作用（Ｇｕｏ?ｅｔａｌ．

甲基化的過(guò)程主要為：ＵＨＲＦ１的同源蛋白ＶＩＭ１／２／３?（Ｖａｒｉａｎｔ?Ｉｎ?Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ?１／２／３）通過(guò)其ＳＲＡ結(jié)??構(gòu)域識(shí)別半甲基化的ＤＭＡ，ＭＥＴ１通過(guò)與Ｖ１Ｍ１／２／３相互作用從而被招募至靶位點(diǎn)，催化新合成的??ＤＮＡ鏈上的甲基化：完成ＤＮＡ甲基化的維持過(guò)程（圖１－４Ｃ）?（Ｋｉｍ?ｅｔ?ａＬ，?２０１４；?Ｗｅｎｄｔｅ?ａｎｄ?Ｓｃｈｍｉｔｚ，??２０１８；?Ｗｏｏ?ｅｔ?ａｌ．，２００８）。研宄發(fā)現(xiàn)ＶＩＭ蛋白在維持ＤＮＡ甲基化的過(guò)程中存在功能冗余，Ｗｗｉ、ｗ＇ｗ２??或咖＾單突變體中ＤＮＡ甲基化水平并無(wú)顯著變化，但是ｖ／ｗ２?ｖ／ｗＪ三突變體中ＣＧ甲基化??水平非常低（Ｓｔｒｏｕｄ?ｅｔ?ａｌ．，?２０１３）。另外有研宄發(fā)現(xiàn)有些位點(diǎn)上ＣＧ甲基化的維持需要去乙�；�??ＨＤＡ６?（ｈｉｓｔｏｎｅ?ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ?６）的參與，它能夠與ＭＥＴ１相互作用從而輔助該類位點(diǎn)進(jìn)行ＣＧ甲基化??的維持（Ｂｌｅｖｉｎｓ?ｅｔａｌ．，?２０１４；?Ｗｅｎｄｔｅ?ａｎｄ?Ｓｃｈｍｉｔｚ，?２０１８）。ＤＮＡ甲基化的維持需要染色質(zhì)重塑因子??ＤＤＭｌ（Ｄｅｃｒｅａｓｅｉｒ＾ＤＮＡＭｅｔｈｙ丨ａｔｉｏｎｌ）的參與，ｃＷｗＪ中定位于異染色質(zhì)區(qū)的一些轉(zhuǎn)座子的ＣＧ甲??基化水平下降非常明顯，因此ＤＤＭ１可能主要調(diào)控異染色質(zhì)區(qū)的染色質(zhì)環(huán)境從而利于ＤＮＡ甲基??轉(zhuǎn)移酶ＭＥＴ１催化異染色質(zhì)區(qū)一些轉(zhuǎn)座子位點(diǎn)上ＣＧ的甲基化（Ｊｅｄｄｅｌｏｈ?ｅｔ?ａｌ．
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 Hsuan Yu Kuo;Elise L.Jacobsen;Yanping Long;Xinyuan Chen;Jixian Zhai;;Characteristics and processing of Pol Ⅳ-dependent transcripts in Arabidopsis[J];Journal of Genetics and Genomics;2017年01期

2 Natalia A Osna;Wayne G Carter;Murali Ganesan;Irina A Kirpich;Craig J Mc Clain;Dennis R Petersen;Colin T Shearn;Maria L Tomasi;Kusum K Kharbanda;;Aberrant post-translational protein modifications in the pathogenesis of alcohol-induced liver injury[J];World Journal of Gastroenterology;2016年27期

本文編號(hào)：2859236