萜類化合物是在植物中廣泛存在的一類次生代謝產(chǎn)物,對植物自身的生長發(fā)育和植物的防御反應過程起著重要的作用,同時也是植物化感作用的媒介物質(zhì)。另外,一些萜類化合物如紫杉醇、青蒿素等具有重要的商業(yè)和醫(yī)療價值。因此,萜類代謝工程目前已經(jīng)成為次生代謝工程研究的重要部分,對于萜類化合物合成途徑中關鍵酶以及編碼各種關鍵酶基因功能的進一步研究就更為重要。梨是薔薇科植物中具有代表性的經(jīng)濟作物,目前對梨基因組內(nèi)萜類合成途徑的關鍵酶基因家族研究較少。梨基因組測序的完成,使得從基因組的角度分析和研究萜類合成途徑關鍵酶基因的家族成為可能。本研究使用生物信息學方法結(jié)合梨基因組數(shù)據(jù)對萜類合成途徑中兩個關鍵酶基因(TPS和HMGR)基因家族進行鑒定和系統(tǒng)進化分析,包括蛋白基本性質(zhì)分析、基因結(jié)構(gòu)分析、蛋白結(jié)構(gòu)域分析以及系統(tǒng)進化分析等,并在此基礎上通過熒光定量PCR對發(fā)現(xiàn)的4個HMGR基因進行組織表達模式、脅迫響應模式等分析。此外,通過構(gòu)建PcHMGR1基因表達載體轉(zhuǎn)化擬南芥,對PcHMGR1基因的功能進行探究。主要研究結(jié)果如下:(1)基于梨基因組數(shù)據(jù)信息,通過Blast分析與結(jié)構(gòu)域篩選相結(jié)合的方法,以GenBank中已經(jīng)注冊的50條TPS蛋白序列作為查詢序列,最終在梨基因組內(nèi)共鑒定得到33個TPS基因。參考擬南芥中TPS基因的命名方式,將梨TPS基因分別命名為PbrTPS1-PbrTPS33。對梨TPS蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹進行進化聚類和分析,并將其分為5個亞家族。(2)梨TPS基因的染色體定位結(jié)果表明,33個TPS基因家族成員分別定位在梨的8條染色體上。其中,定位到第12條染色體上的TPS基因序列數(shù)量最多。在第8條、第10條和第17條染色體上各定位得到一個基因。亞細胞定位結(jié)果表明,33個TPS蛋白大部分定位于細胞質(zhì),少數(shù)分布在線粒體、葉綠體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等;α-螺旋和無規(guī)卷曲是其二級結(jié)構(gòu)主要組成元件,β-折疊和延伸鏈散布其中。(3)使用生物信息學的方法在梨基因組內(nèi)共鑒定出4個HMGR基因,分別命名為PcHMGR1、PcHMGR2、PcHMGR3和PcHMGR4。分析表明,除PcHMGR3是不穩(wěn)定蛋白,其余均為穩(wěn)定蛋白。亞細胞定位分析結(jié)果表明,PcHMGR1和PcHMGR3定位于細胞質(zhì)中,PcHMGR2定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,PcHMGR4定位于葉綠體中。系統(tǒng)進化分析結(jié)果表明,PcHMGR1和PcHMGR4基因在進化關系上更接近。使用GSDS在線網(wǎng)站進行PcHMGR的基因結(jié)構(gòu)分析,結(jié)果表明,PcHMGR1、PcHMGR2和PcHMGR3具有基本一致的外顯子內(nèi)含子結(jié)構(gòu),PcHMGR1具有4個外顯子和3個內(nèi)含子。(4)將梨HMGR氨基酸序列提交到MEME進行蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析,在輸出的motif中發(fā)現(xiàn)梨HMGR蛋白含有4個保守位點,包括兩個HMG-COA結(jié)合位點(EMPVGYVQIP和TTEGCLVA)和兩個NADP(H)結(jié)合位點(DAMGMNM和GTVGGGT)。GO功能注釋結(jié)果分析表明,4個基因同樣注釋到以下8個功能組,參與到氧化還原過程、輔酶A的代謝過程和類異戊二烯的合成過程,同時也具有多種結(jié)合和催化活性以及和細胞膜系統(tǒng)的相關性。(5)組織表達模式分析結(jié)果表明,PcHMGR1在幼葉和莖中的表達量最高,PcHMGR2和PcHMGR3在新生的幼葉和幼芽中表達量最高,PcHMGR4在根中表達量最高。在生物脅迫和非生物脅迫條件下的表達模式分析表明,PcHMGR1和PcHMGR4具有相似的表達模式,PcHMGR2和PcHMGR3表達模式同樣高度相似。(6)構(gòu)建35S啟動子啟動的真核表達載體轉(zhuǎn)化擬南芥,對轉(zhuǎn)基因植株進行基因組水平和轉(zhuǎn)錄水平鑒定,成功獲得過表達PcHMGR1的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。萜類代謝途徑關鍵酶基因表達分析結(jié)果表明,在幼苗期,AtAACT1和AtHMGR2上調(diào)表達外,而在盛花期,AtAACT1、AtAACT2、AtFPS1、AtFPS2以及MEP代謝途徑關鍵酶基因AtDXS上調(diào)表達。這些結(jié)果表明在擬南芥中過表達PcHMGR1影響了萜類代謝途徑上下游其它關鍵酶基因的表達。(7)過表達PcHMGR1基因提高了擬南芥中萜類代謝產(chǎn)物(如葉綠素、類胡蘿卜素)的產(chǎn)生,同時增加了下游揮發(fā)性萜類物質(zhì)的種類。在氧化脅迫處理后,野生型相對于轉(zhuǎn)基因擬南芥表現(xiàn)出更嚴重的萎蔫失綠情況,轉(zhuǎn)基因株系具有更高的抗氧化酶(SOD、APX和CAT)活性,同時MDA含量顯著低于野生型,這表明過表達PcHMGR1提高了擬南芥的抗氧化脅迫能力。
【學位單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：Q943.2;S661.2
【部分圖文】：

圖 1-1 植物中的萜類合成途徑（Bindu et al., 2017）Fig. 1-1 The pathway of terpenoids biosynthesis in plant (Bindu et al., 2017)途徑間的交流，兩條萜類合成途徑之間并不是孤立存在的，它們之間存在

圖 3-1 梨 TPS 基因家族進化樹Fig. 3-1 The neighbor-joining phylogenetic tree of TPS family in pear基因家族生物信息學分析R 基因家族成員的鑒定分析

圖 3-2 PcHMGR 蛋白保守基序分析（A）預測的保守 motif1-motif5；（B）梨 HMGR 蛋白中的基序分布，使用 MEME 網(wǎng)站鑒定 HMGR 蛋白的基序，不同的基序使用不同顏色表示。Fig. 3-2 motif distribution analysis(A) The details of predicted conserved motif1 to motif5, (B) The motif distribution in PcHMGR proteins, motifs HMGR proteins were identified using the MEME web server. Different motifs are highlighted in different color boxes wi
【參考文獻】

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本文編號：2859166