植物根部木栓質(zhì)在植物抵御各種生物和非生物脅迫中具有重要作用。二穗短柄草作為麥類作物重要的模式植物,研究其與抗旱相關(guān)基因和機理,可為小麥等重要作物的研究提供借鑒。本論文通過氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)和氣相色譜(GC)分析了二穗短柄草根中木栓質(zhì)的組成和含量及其變化特點。利用擬南芥木栓質(zhì)脂肪醇合成酶基因AtFAR1的蛋白序列在二穗短柄草數(shù)據(jù)庫中分別進行同源比對,對獲得的同源序列進行生物信息學分析,確定出了二穗短柄草木栓質(zhì)脂肪醇合成酶相關(guān)的候選基因;分析候選基因在不同組織的表達特征,從中選擇重要的候選基因進行了克隆和功能驗證。研究結(jié)果如下:1.二穗短柄草根中木栓質(zhì)組成成分有初級脂肪醇、脂肪酸、ω-羥基脂肪酸和α,ω-二羧酸,物質(zhì)組成與已經(jīng)發(fā)表的擬南芥和其他物種的木栓質(zhì)組成成分相似。但是在組成成分的含量上存在一定的差異。2.二穗短柄草基因組中存在6個候選基因,共編碼6個蛋白質(zhì)。氨基酸序列多重比對后顯示,只有BdFAR4(Bradi3g20000)與AtFAR1具有50%以上的氨基酸一致性,BdFAR1(Bradi4g38460)、BdFAR2(Bradi3g42780)、BdFAR3(Bradi4g37860)、BdFAR4(Bradi3g20000)、BdFAR5(Bradi1g73877)和BdFAR6(Bradi4g37860)與AtFAR1的氨基酸序列一致性分別是40.34%、42.30%、45.20%、50.80%、35.61%和44%。通過生物信息學分析,推測這些基因可能具有合成初級脂肪醇的功能。前期我們已克隆了BdFAR1、BdFAR2和BdFAR3,并已證明BdFAR1、BdFAR2和BdFAR3參與二穗短柄草葉片表皮蠟質(zhì)中脂肪醇的合成;而BdFAR4主要在根中表達。因此,我們推測BdFAR4可能參與二穗短柄草根中木栓質(zhì)脂肪醇的合成。3.在酵母中異源表達BdFAR4基因表明,BdFAR4具有編碼脂肪酰基輔酶A的功能。通過構(gòu)建酵母表達載體,轉(zhuǎn)化酵母與提取酵母產(chǎn)物檢測后,我們發(fā)現(xiàn)相比于空載體,轉(zhuǎn)化了目的基因的酵母菌株中合成了鏈長為C20和C22的脂肪醇。4.在番茄中異源表達BdFAR4基因表明,轉(zhuǎn)基因番茄T_1代的根中木栓質(zhì)脂肪醇的含量顯著增加,其中以鏈長為C20和C22的初級脂肪醇增加最多。與空載體植株相比,轉(zhuǎn)基因植株根中木栓質(zhì)脂肪醇的含量明顯增加了1.4-1.7倍,其中鏈長為C20的初級脂肪醇增加了1.3-1.8倍,鏈長為C22的初級脂肪醇增加了1.4-1.8倍。綜上結(jié)果表明BdFAR4具有合成木栓質(zhì)脂肪醇的功能,并且主要合成鏈長為C20和C22的初級脂肪醇。
【學位單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：Q943.2
【部分圖文】：

甲苯胺藍、熒光黃 88、小蘗堿和蘇丹紅對含木栓質(zhì)的組織染色，使用熒光顯微鏡可測到木栓質(zhì)的脂類物質(zhì)、酚類物質(zhì)和其他組成木栓質(zhì)的物質(zhì)(Brundrett et al. 1988)。這些染色技術(shù)我們在植物的根部、周皮和塊莖部位發(fā)現(xiàn)了木栓質(zhì)，但是由于染色技夠靈敏，在木栓質(zhì)合成的早期以及植物生長的不同時期木栓質(zhì)合成較少時會存在檢到木栓質(zhì)的情況。例如研究者對擬南芥發(fā)育后期的種子染色發(fā)現(xiàn)只在種子合點區(qū)域，利用熒光黃 88 染料或蘇丹紅 7B 對植物(Gyceria maxima)根進行染色也沒有檢測栓質(zhì)的存在，但是對 Gyceria maxima 木栓質(zhì)進行氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)分析，該植物的根部已經(jīng)形成了較多的脂肪類物質(zhì)，使用熒光顯微鏡觀察該植物根的橫發(fā)現(xiàn)酚類物質(zhì)已經(jīng)開始沉積(Schreibe, 2007; Beisson et al. 2007; Franke et al. 2009)。透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，木栓質(zhì)的片層結(jié)構(gòu)呈明暗相間的結(jié)構(gòu)，并有研究者發(fā)現(xiàn)質(zhì)的深色帶層與酚類物質(zhì)的含量有關(guān)，淺色帶層的厚度與木栓質(zhì)脂類物質(zhì)中的脂肪烷基鏈長度相關(guān)(Buchala and Ryser; 1996; Bernards, 2002)。有研究發(fā)現(xiàn)在栓皮櫟的根木栓化的過程中，木栓質(zhì)最早出現(xiàn)在栓皮櫟的內(nèi)皮層凱氏帶中(Machado et al.13)。植物細胞壁中木栓質(zhì)的分布以及組成木栓質(zhì)的化學物質(zhì)會因為植物的發(fā)育階及各組織的不同功能而有所差異。

圖 1-2 木栓質(zhì)合成及其運輸至細胞壁的路徑概述（韓雪源和茅林春，2017）Fig.1-2 Overview of the suberin biosynthetic pathway with subsequent transportto the cell wall組成木栓質(zhì)的單體物質(zhì)主要是超長鏈脂肪酸衍生物(C18-C30)、ω-羥基脂肪酸和α羧酸。因此，木栓質(zhì)生物合成過程中兩個重要的步驟是脂肪酸延長和ω-碳氧化。脂的合成發(fā)生在細胞質(zhì)體內(nèi)，主要由脂肪酸合成酶復合體(fatty acids synthmplex,FAS)催化合成的，脂肪酸的合成需經(jīng)過縮合、還原、脫氫和還原四步反應。合反應：在β-酮酰-ACP 合成酶(β-ketoacyl-ACP synthases, KAS)的催化下，�；�-A來自 2C 供體的丙二酰-ACP(malonyl-ACP)發(fā)生反應，產(chǎn)生 4C 的中間產(chǎn)物β-酮酰-A)還原反應：在β-酮酰-ACP 還原酶(β-ketoacyl-ACP reductase, KAR)的作用下，將 4C酮酰-ACP 還原為 4C 的β-羥酰-ACP。(3)脫氫反應：4C 的β-羥酰-ACP 在β-羥酰-A水酶(β-hydroxyacyl-ACP dehydrase, DH)的催化下脫掉一個水分子形成 4C 的反式-酰 ACP。(4)還原反應：在反式-△2-烯酰 ACP 還原酶（trans-△2-enoyl-ACP reductR）作用下，將 4C 的反式-△2-烯酰 ACP 還原為 4C 的�；�-ACP。這樣每經(jīng)過一個，就多增加 2 個碳原子，大概經(jīng)過 6~7 次循環(huán)后，就形成了 C16或 C18的酰基-AC

第三章 二穗短柄草木栓質(zhì)脂肪醇合成酶基因 BdFAR4 的克隆 白質(zhì)序列，利用 MEGA 6.06 軟件與來自普通小麥和擬南芥樹分析。如圖 3-2 所示，這些同源蛋白序列可以分為兩大類白，一類是小麥中的同源蛋白，而二穗短柄草中的 BdFAAR4、BdFAR5 和 BdFAR6 與擬南芥和小麥中的同源基因聚合小麥中的FAR基因聚在一支可能的原因是二穗短柄草和小麥同源關(guān)系較近。由此推測候選基因 BdFAR1、BdFAR2、BdFFAR6 可能具有合成初級脂肪醇的功能，可能參與植物根中
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 韓雪源;茅林春;;木栓質(zhì)組成成分、組織化學特性及其生物合成研究進展[J];植物學報;2017年03期

相關(guān)碩士學位論文 前1條

1 孫瑜琳;小麥葉片和穗表皮蠟質(zhì)組分分析及其相關(guān)合成基因的篩選[D];西北農(nóng)林科技大學;2015年

本文編號：2859001