百合的花香層次豐富,不同的類群花香不同。大部分亞洲百合沒有香味;而東方百合香味過于濃烈,很多消費(fèi)者并不喜歡。所以增加亞洲百合的香味,降低東方百合的香味是百合育種家試圖實(shí)現(xiàn)的目標(biāo)。東方百合中致香的關(guān)鍵成分是單萜類物質(zhì),所以對百合花香基因的研究主要集中在單萜合成酶基因。單萜類物質(zhì)成分和含量隨品種不同而不同,為了研究單萜合成酶基因在不同品種百合中的多態(tài)性,本試驗(yàn)在66個(gè)百合品種中克隆百合單萜合成酶基因,一共獲得32個(gè)單萜合成酶基因,這些基因可以分為三類:LTPS-a、LTPS-b 和 LTPS-c,在 32 個(gè)基因中有 23 個(gè)屬于 LTPS-a,2 個(gè)屬于 LTPS-b,7個(gè)屬于LTPS-c。其中有71.01%的品種中都含有LTPS-a,它的開放閱讀框有1761bp,編碼586個(gè)氨基酸·,克隆到的LTPS-b數(shù)量最少,只存在于8.70%的品種中,有12個(gè)堿基的插入,它的開放閱讀框有1773bp,編碼590個(gè)氨基酸;有36.23%的品種中都含有LTPS-c,它缺失114個(gè)堿基,開放閱讀框有1647bp,編碼548個(gè)氨基酸。三類單萜合成酶都存在萜類合酶保守域DDxxD和單萜類合酶保守域RRx8W。LTPS-a和LTPS-b存在底物結(jié)合保守域RX8H,但LTPS-c不存在此保守域。三類單萜合成合酶中分別有55、8、39個(gè)SNPs,LTPS-a的核酸多態(tài)性指數(shù)最大。研究基因多態(tài)性與單萜類物質(zhì)釋放量的關(guān)系發(fā)現(xiàn),第230,873位點(diǎn)的突變和α-蒎烯的釋放量相關(guān)性最大,而第99,101,407,1108,1150,1225位點(diǎn)的突變和羅勒烯的釋放量相關(guān)性最大。從有香百合O1 1中克隆到三種單萜合成酶基因:LsoTPS-α、LsoTPS-b和LsoTPS-c,無香百合AT6中克隆到兩種單萜合成酶:LrlTPS-a和LrlTPS-c,構(gòu)建這五個(gè)基因的超表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá),誘導(dǎo)后上述五個(gè)基因在大腸桿菌中均有表達(dá),但亞洲百合中的LrlTPS-c表達(dá)量較低,通過超聲波破碎法提取蛋白用于體外酶活性分析,在蛋白中加入單萜合成酶的底物香葉基焦磷酸(GPP),5個(gè)基因均可把GPP轉(zhuǎn)化為羅勒烯。
【學(xué)位單位】：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S682.29
【部分圖文】：

２．２．１總ＲＮＡ的提取??利用Ｔｎｚｏｌ裂解液提�。叮秱�(gè)百合品種盛丌期花瓣的總ＲＮＡ，�。催策M(jìn)行瓊脂糖??凝膠電泳以檢測其質(zhì)量，通過生物光度ｉｌ檢測總含鼠和質(zhì)■＾圖２顯示Ａ３、Ａ５、Ａ６??和Ａ７的ＲＮＡ電泳圖，表明提取的ＲＮＡ既無降解、也尤污染。??氣爭ｉ?ｉ?丨??、養(yǎng)一雙，善要－．辱?１０００???ｓｅｃ??．＇ｔ??圖２?Ａ３、?Ａ５、?Ａ６?＃卩Ａ７總ＲＮＡ電泳圖??Ｆｉｇ．?２?Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｐａｔｔｅｒｎ?ｏｆ?ＲＮＡｓ?ｉｎ?Ａ３，?Ａ５，?Ａ６?ａｎｄ?Ａ７??２．２．２單萜合成酶基因序列分析??以反轉(zhuǎn)錄得到的ｃＤＮＡ為模板進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，在６６個(gè)品種中都得到一條１７００ｂｐ??左右的片段，將此片段進(jìn)行克隆測序獲得序列信息。６６個(gè)百合品種中一共得到３２個(gè)單??萜合成酶基因可分為三個(gè)類型，命名為ＬＴＰＳ－ａ、ＬＴＰＳ－ｂ、ＬＴＰＳ－ｃ（圖３）。ＬＴＰＳ－ａ型序列??有２３個(gè)，ＬＴＰＳ－ｂ型序列有２個(gè)，ＬＴＰＳ－ｃ型序列有７個(gè)。這３２個(gè)基因可以翻譯成２３??個(gè)蛋白

以反轉(zhuǎn)錄得到的ｃＤＮＡ為模板進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，在６６個(gè)品種中都得到一條１７００ｂｐ??左右的片段，將此片段進(jìn)行克隆測序獲得序列信息。６６個(gè)百合品種中一共得到３２個(gè)單??萜合成酶基因可分為三個(gè)類型，命名為ＬＴＰＳ－ａ、ＬＴＰＳ－ｂ、ＬＴＰＳ－ｃ（圖３）。ＬＴＰＳ－ａ型序列??有２３個(gè)，ＬＴＰＳ－ｂ型序列有２個(gè)，ＬＴＰＳ－ｃ型序列有７個(gè)。這３２個(gè)基因可以翻譯成２３??個(gè)蛋白，ＬＴＰＳ－ａ型蛋白有１４個(gè)，ＬＴＰＳ－ｂ型蛋白有２個(gè)，ＬＴＰＳ－ｃ型蛋白有７個(gè)，將這??些基因序列提交ＮＣＢＩ，得到登錄號（表５）。這三種ＬＴＰＳ基因在不同百合雜種系的??分布也不同，如表６所示，ＬＴＰＳ－ｂ在所有品種中的分布是最少的（占品種數(shù)的８．７０％），??只在六個(gè)品種中發(fā)現(xiàn)它，喇東百合、亞喇百合、麝東百合中均未克隆得到ＬＴＰＳ－ｂ；?ＬＴＰＳ－ａ??在所有品種中的分布是最廣泛的，分布于７６．８１％的品種中；ＬＴＰＳ－ｃ的分布范圍居中，??分布于２６．０９％的品種中。－些百合品種中同時(shí)克隆到２到３種單萜合成酶基因，例如：??Ａ３、Ａ８、ＡＴ６、Ｔｌ、０Ｔ１３?和?ＯＴ１６?都含有?ＬＴＰＳ－ａ?和?ＬＴＰＳ－ｃ。Ｎ１?含有?ＬＴＰＳ－ａ?和?ＬＴＰＳ－ｂ

圈６嚷｜邦百合單萜合成酶越閃第：？：到第四個(gè)外顯＋的局部示意圖??Ｆｉｇ．?６?Ｄｉａｇｒａｍ?ｄｅｐｉｃｔｉｎｇ?ｔｈｅ?ｅｘｏｎ３?ｔｏ?ｅｘｏｎ４?ｏｉ＇?Ｌｉ／ｉｕｍ?ｍｏｎｏｔｅｉ－ｐｅｎｅ?ｓｙｔｈａｓｅ?ｇｅｎｅ??
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2858876