百合的花香層次豐富,不同的類群花香不同。大部分亞洲百合沒有香味;而東方百合香味過于濃烈,很多消費者并不喜歡。所以增加亞洲百合的香味,降低東方百合的香味是百合育種家試圖實現(xiàn)的目標。東方百合中致香的關鍵成分是單萜類物質,所以對百合花香基因的研究主要集中在單萜合成酶基因。單萜類物質成分和含量隨品種不同而不同,為了研究單萜合成酶基因在不同品種百合中的多態(tài)性,本試驗在66個百合品種中克隆百合單萜合成酶基因,一共獲得32個單萜合成酶基因,這些基因可以分為三類:LTPS-a、LTPS-b 和 LTPS-c,在 32 個基因中有 23 個屬于 LTPS-a,2 個屬于 LTPS-b,7個屬于LTPS-c。其中有71.01%的品種中都含有LTPS-a,它的開放閱讀框有1761bp,編碼586個氨基酸·,克隆到的LTPS-b數(shù)量最少,只存在于8.70%的品種中,有12個堿基的插入,它的開放閱讀框有1773bp,編碼590個氨基酸;有36.23%的品種中都含有LTPS-c,它缺失114個堿基,開放閱讀框有1647bp,編碼548個氨基酸。三類單萜合成酶都存在萜類合酶保守域DDxxD和單萜類合酶保守域RRx8W。LTPS-a和LTPS-b存在底物結合保守域RX8H,但LTPS-c不存在此保守域。三類單萜合成合酶中分別有55、8、39個SNPs,LTPS-a的核酸多態(tài)性指數(shù)最大。研究基因多態(tài)性與單萜類物質釋放量的關系發(fā)現(xiàn),第230,873位點的突變和α-蒎烯的釋放量相關性最大,而第99,101,407,1108,1150,1225位點的突變和羅勒烯的釋放量相關性最大。從有香百合O1 1中克隆到三種單萜合成酶基因:LsoTPS-α、LsoTPS-b和LsoTPS-c,無香百合AT6中克隆到兩種單萜合成酶:LrlTPS-a和LrlTPS-c,構建這五個基因的超表達載體,轉化到大腸桿菌中進行表達,誘導后上述五個基因在大腸桿菌中均有表達,但亞洲百合中的LrlTPS-c表達量較低,通過超聲波破碎法提取蛋白用于體外酶活性分析,在蛋白中加入單萜合成酶的底物香葉基焦磷酸(GPP),5個基因均可把GPP轉化為羅勒烯。
【學位單位】：山西農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S682.29
【部分圖文】：

２．２．１總ＲＮＡ的提取??利用Ｔｎｚｏｌ裂解液提�。叮秱�百合品種盛丌期花瓣的總ＲＮＡ，�。催策M行瓊脂糖??凝膠電泳以檢測其質量，通過生物光度ｉｌ檢測總含鼠和質■＾圖２顯示Ａ３、Ａ５、Ａ６??和Ａ７的ＲＮＡ電泳圖，表明提取的ＲＮＡ既無降解、也尤污染。??氣爭ｉ?ｉ?丨??、養(yǎng)一雙，善要－．辱?１０００???ｓｅｃ??．＇ｔ??圖２?Ａ３、?Ａ５、?Ａ６?＃卩Ａ７總ＲＮＡ電泳圖??Ｆｉｇ．?２?Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｐａｔｔｅｒｎ?ｏｆ?ＲＮＡｓ?ｉｎ?Ａ３，?Ａ５，?Ａ６?ａｎｄ?Ａ７??２．２．２單萜合成酶基因序列分析??以反轉錄得到的ｃＤＮＡ為模板進行ＰＣＲ擴增，在６６個品種中都得到一條１７００ｂｐ??左右的片段，將此片段進行克隆測序獲得序列信息。６６個百合品種中一共得到３２個單??萜合成酶基因可分為三個類型，命名為ＬＴＰＳ－ａ、ＬＴＰＳ－ｂ、ＬＴＰＳ－ｃ（圖３）。ＬＴＰＳ－ａ型序列??有２３個，ＬＴＰＳ－ｂ型序列有２個，ＬＴＰＳ－ｃ型序列有７個。這３２個基因可以翻譯成２３??個蛋白

以反轉錄得到的ｃＤＮＡ為模板進行ＰＣＲ擴增，在６６個品種中都得到一條１７００ｂｐ??左右的片段，將此片段進行克隆測序獲得序列信息。６６個百合品種中一共得到３２個單??萜合成酶基因可分為三個類型，命名為ＬＴＰＳ－ａ、ＬＴＰＳ－ｂ、ＬＴＰＳ－ｃ（圖３）。ＬＴＰＳ－ａ型序列??有２３個，ＬＴＰＳ－ｂ型序列有２個，ＬＴＰＳ－ｃ型序列有７個。這３２個基因可以翻譯成２３??個蛋白，ＬＴＰＳ－ａ型蛋白有１４個，ＬＴＰＳ－ｂ型蛋白有２個，ＬＴＰＳ－ｃ型蛋白有７個，將這??些基因序列提交ＮＣＢＩ，得到登錄號（表５）。這三種ＬＴＰＳ基因在不同百合雜種系的??分布也不同，如表６所示，ＬＴＰＳ－ｂ在所有品種中的分布是最少的（占品種數(shù)的８．７０％），??只在六個品種中發(fā)現(xiàn)它，喇東百合、亞喇百合、麝東百合中均未克隆得到ＬＴＰＳ－ｂ；?ＬＴＰＳ－ａ??在所有品種中的分布是最廣泛的，分布于７６．８１％的品種中；ＬＴＰＳ－ｃ的分布范圍居中，??分布于２６．０９％的品種中。－些百合品種中同時克隆到２到３種單萜合成酶基因，例如：??Ａ３、Ａ８、ＡＴ６、Ｔｌ、０Ｔ１３?和?ＯＴ１６?都含有?ＬＴＰＳ－ａ?和?ＬＴＰＳ－ｃ。Ｎ１?含有?ＬＴＰＳ－ａ?和?ＬＴＰＳ－ｂ

圈６嚷｜邦百合單萜合成酶越閃第：？：到第四個外顯＋的局部示意圖??Ｆｉｇ．?６?Ｄｉａｇｒａｍ?ｄｅｐｉｃｔｉｎｇ?ｔｈｅ?ｅｘｏｎ３?ｔｏ?ｅｘｏｎ４?ｏｉ＇?Ｌｉ／ｉｕｍ?ｍｏｎｏｔｅｉ－ｐｅｎｅ?ｓｙｔｈａｓｅ?ｇｅｎｅ??
【參考文獻】

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本文編號：2858876