野菊(Chrysanthemum indicum)為多年生植物,具有抗性強、耐瘠薄、養(yǎng)護粗放、覆蓋力強等特點,在城市園林中應(yīng)用價值較高。在當(dāng)今城市建筑密集、綠化空間窄小的情況下,立體綠化正在各地廣泛應(yīng)用。立體綠化中重要的基礎(chǔ)材料是匍匐植物,匍匐植物在山坡、墻面、屋頂、籬垣、棚架、柱狀體、林下綠化及室內(nèi)裝飾等方面具有不可取代的作用,但市場上對匍匐性狀的植物種類應(yīng)用較少。分子育種是一種重要的育種方式,其中,又以轉(zhuǎn)基因育種手段最為成熟,運用這種技術(shù)培育菊花品種可能會為匍匐性菊花的獲得提供方法。根據(jù)本實驗室的前期研究結(jié)果,野菊ChiMYB基因過表達的煙草植株出現(xiàn)了匍匐性狀,本試驗欲做出進一步探索,將該基因轉(zhuǎn)入野菊中使其過量表達,觀察野菊是否會出現(xiàn)類似性狀,并為后期的育種工作奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:1、優(yōu)化野菊的再生體系。以野菊組織培養(yǎng)苗為試驗材料,通過用不同生長調(diào)節(jié)劑組合對葉片分化的研究,發(fā)現(xiàn)在MS+1.0mg/L6-BA+0.8mg/LNAA上,葉片的分化率最高;在遺傳轉(zhuǎn)化過程的后期,用抗生素對轉(zhuǎn)化植株進行篩選是必不可少的。本實驗確定了8mg/L和10mg/L卡那霉素分別作為葉片分化的篩選壓力和野菊生根最適宜的臨界濃度,選用200mg/L頭抱霉素作為抑菌劑為野菊葉盤分化適宜的臨界濃度。抗生素不僅對農(nóng)桿菌具有抑制作用甚至殺傷威力,而且對野菊的葉盤也有一定的影響。因此試驗中要篩選適宜濃度的抗生素,抑制農(nóng)桿菌和非轉(zhuǎn)化細胞生長的同時,避免影響轉(zhuǎn)化植株的正常生長。2、利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將ChiMYB基因轉(zhuǎn)入野菊中,得到過表達ChiMYB基因的轉(zhuǎn)基因野菊植株。結(jié)果表明,取繼代苗為材料,切成0.5cm×0.5cm的小塊,在預(yù)培養(yǎng)基:MS+1.0mg/L6-BA+0.8mg/LNAA預(yù)培養(yǎng)2d;農(nóng)桿菌活化至菌液濃度OD_(600)為0.8-1.0后,離心收集菌體并用1/2MS液體培養(yǎng)基稀釋菌液濃度OD_(600)為0.2時侵染8min,吸去多余菌液后放入原培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)2d后;轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基:MS+1.0mg/L6-BA+0.8mg/LNAA+8mg/LKan+200mg/LCef中,待不定芽長至2cm左右時,用無菌手術(shù)刀片將其切下,轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)基因生根培養(yǎng)基:1/2MS+10mg/LKan培養(yǎng)至生根成苗。3、利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將ChiMYB基因和pBI121空載體轉(zhuǎn)入野生型野菊植株體內(nèi),通過抗性生根篩選、抗性植株DNA和RNA的PCR檢測,證明已成功過獲得2株轉(zhuǎn)ChiMYB基因和2株轉(zhuǎn)pBI121空載體的陽性轉(zhuǎn)野菊株系。利用qRT-PCR檢測ChiMYB基因在不同野菊株系中的表達量,其在轉(zhuǎn)空載株系和野生型野菊中的表達量相差無幾,在轉(zhuǎn)基因株系L1的表達量最高,是野生型野菊的11.2倍,在轉(zhuǎn)基因株系L4的表達量是野生型野菊的6.7倍,表明ChiMYB基因在轉(zhuǎn)基因株系中的表達量均提高。
【學(xué)位單位】：佳木斯大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S682.11
【部分圖文】：

轉(zhuǎn)基因野菊Fig.1TransgenicChrysanthemumindicumCD

而 10 沒有條帶為假陽性轉(zhuǎn)基因植株。PCR 驗證野菊 DNA 結(jié)果顯示，實驗成功獲得2 株轉(zhuǎn)ChiMYB 基因，2 株轉(zhuǎn) pBI121 空載的野菊。圖2 轉(zhuǎn)基因野菊植株DNA 的PCR 鑒定Fig.2 Confirmation of the presence of the transgene by PCR in different transgenic lines M：DL20003、轉(zhuǎn)基因植株 RNA 的檢測為了進一步驗證 ChiMYB 基因在轉(zhuǎn)基因野菊中的表達情況，提取轉(zhuǎn)基因植株、轉(zhuǎn)空載植株和野生型野菊植株葉片的總 RNA，以反轉(zhuǎn)的 cDAN 為模板，以 ChiMYB-SmaI/ChiMYB-SpeI 特異性引物和 nptII 引物序列進行 PCR，同時以含 pBI121-MYB 重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌質(zhì)粒為模板的陽性對照。檢測結(jié)果為圖3，1是以含 pBI121-MYB 重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌質(zhì)粒為模板的陽性對照，2為是野生型野菊植株，3-4為轉(zhuǎn) ChiMYB 基因野菊植株

體上的抗性基因已成功整合到野菊基因組上。PCR 驗證野菊 RNA 結(jié)果顯示，實驗成功獲得2株轉(zhuǎn) ChiMYB 野菊植株與2株轉(zhuǎn)空載野菊植株。圖3 轉(zhuǎn)基因野菊植株RNA 的PCR 鑒定Fig.3 Confirmation of the presence of the transgene by PCR in different transgenic lines M：DL20004、熒光定量的檢測ChiMYB 基因在轉(zhuǎn)空載株系和野生型野菊中的表達量相差無幾，在轉(zhuǎn)基因株系 L1的表達量最高，是野生型野菊的 11.2 倍，在轉(zhuǎn)基因株系 L4 的表達量是野生型野菊的6.7 倍，ChiMYB 在轉(zhuǎn)基因株系中的表達量均提高。圖 4 ChiMYB 基因在不同轉(zhuǎn)基因野菊中的表達Fig.4 Expression of ChiMYB gene in different Transgenic Chrysanthemum indicum2000bp250bp100bp750bp1000bp500bp
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 皮偉;李名揚;;根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)FPF1基因轉(zhuǎn)化菊花的研究[J];西南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2007年04期

2 唐巍;菊花離體快速繁殖的研究[J];生物技術(shù);1993年02期

本文編號：2858718