GaHD1基因?yàn)镠D-ZIP IV轉(zhuǎn)錄因子家族成員,主要起信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用,其最終的信號受體為纖維發(fā)育相關(guān)功能基因。已有的相關(guān)報道發(fā)現(xiàn)GaHD1是控制茸毛和纖維起始的關(guān)鍵調(diào)控基因,并受赤霉素(GA3)誘導(dǎo)(本項(xiàng)目研究基礎(chǔ))。為了探索GaHD1的上游調(diào)控基因,同時驗(yàn)證GaHD1是否為正反饋調(diào)節(jié)基因,我們運(yùn)用生物信息學(xué)方法,提取GaHD1上游啟動子調(diào)控區(qū)域,分析其中是否含有HD1基因結(jié)合的順式作用元件L1box,并預(yù)測和驗(yàn)證了直接調(diào)控GaHD1的上游基因。主要結(jié)果如下:1.首先克隆得到了GaHD1基因啟動子,生物信息學(xué)分析啟動子區(qū)潛在的順式作用元件,根據(jù)L1box存在的位置,克隆了不同長度的4條啟動子片段(HD1-Pro-R1、HD1-Pro-R2、HD1-Pro-Intron、HD1-Pro-full Length),分別構(gòu)建了這4種啟動子片段與GUS報告基因融合的植物表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化擬南芥。GUS活性分析表明,4個啟動子片段驅(qū)動GUS的表達(dá)情況有差異,其中,HD1-Pro-R1染色很淡,莖稈、葉片茸毛均無染色。HD1-Pro-R2顏色較深,葉片、莖稈茸毛均被染色,這可能是由于R2片段相較R1多了L1box,說明L1box是在茸毛中表達(dá)的非常重要的元件。HD1-Pro-Intron片段包括5’-UTR區(qū)域且只在葉片邊緣有GUS染色,說明5’-UTR區(qū)有在葉片邊緣特異性表達(dá)元件。HD1-Pro-full Length GUS活性極高,在幾乎所有區(qū)域均表達(dá)。說明UTR部分的內(nèi)含子元件可以使該啟動子不僅可在葉片邊緣特異性表達(dá),還具有啟動子增強(qiáng)作用。隨后我們對轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片進(jìn)行GUS活力檢測,結(jié)果顯示:HD1-Pro-R1和HD1-Pro-Intron GUS活力水平較低,而HD1-Pro-R2和HD1-Pro-full Length GUS活力水平很高,與染色結(jié)果一致,且達(dá)到顯著水平。另外,我們將轉(zhuǎn)HD1-Pro-full Length啟動子的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株做石蠟切片,發(fā)現(xiàn)GUS活性在其莖和葉片表皮細(xì)胞中高亮表達(dá)。同時,我們用5μM GA3處理轉(zhuǎn)基因擬南芥植株,結(jié)果顯示,GA3處理后,HD1-Pro-R1和HD1-Pro-Intron GUS染色及其活力水平相較于處理前均幾乎無變化,而HD1-Pro-R2和HD1-Pro-full Length因?yàn)楹琇1box,GUS活性均有所增加。這說明GA3能夠誘導(dǎo)某些基因或轉(zhuǎn)錄因子起到結(jié)合L1box調(diào)控HD1基因表達(dá)的作用。2.體外驗(yàn)證GaHD1的上游調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子,克隆了已知的與棉纖維發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(GaHD1,GaHOX3,GaPDF2,GaMML9),分別將其與PCY載體融合,轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體,其中GaPDF2和GaMML9先前未研究過,我們對其進(jìn)行了亞細(xì)胞定位的研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩個轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子都在細(xì)胞核中表達(dá)。3.為了明確GaHD1,GaHOX3,GaPDF2,GaMML9這四個轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子與GaHD1啟動子的關(guān)系,本研究采用酵母單雜交方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn),GaHD1啟動子能夠與GaHD1,GaPDF2,GaMML9調(diào)節(jié)因子結(jié)合,不能與GaMML7,GaHOX3結(jié)合,說明GaHD1可以與自身基因結(jié)合;GaPDF2,GaMML9是HD1上游轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。4.利用煙草瞬時轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)體內(nèi)驗(yàn)證GaHD1的上游調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子,結(jié)果發(fā)現(xiàn),啟動子HD1-Pro-R1和HD1-Pro-Intron,分別共轉(zhuǎn)化GaHD1,GaHOX3,GaPDF2,GaMML9調(diào)節(jié)因子后GUS活力水平和單一啟動子相比無明顯變化;啟動子HD1-Pro-R2和HD1-Pro-full Length含有L1box,分別共轉(zhuǎn)化GaHOX3后GUS活力無顯著變化,而分別共轉(zhuǎn)化GaHD1,GaPDF2或GaMML9后煙草的GUS活力水平比單一啟動子明顯增強(qiáng),說明GaHD1,GaPDF2,GaMML9能夠結(jié)合到GaHD1啟動子上并增強(qiáng)GaHD1基因表達(dá),該試驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)了HD1上游的調(diào)控因子。
【學(xué)位單位】：浙江農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S562
【部分圖文】：

圖 1.3 HD-ZIP 家族蛋白結(jié)構(gòu)HD：同源異型框；LZ：異亮氨酸拉鏈域; N-Term: N 末端一致序列; START: 脂質(zhì)/類固醇結(jié)合受體; MEKHLA: 較保守的 MEKHLA 序列[61]Figure1.3 Schematic representation of the distinctive features exhibited by each HD-ZIP subfamilyHD: Homeodomain; LZ: Leucine-zipper; N-Term: N-terminus consensus; START: Steroidogenic acuregulatory protein-related lipid transfer domain; MEKHLA: Named after the highly conserved aminoacids Met, GLu, Lys, His, Leu,Ala1.3.1 HD-ZIP Ⅳ轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)HD-ZIP Ⅳ轉(zhuǎn)錄因子與 HD-ZIP Ⅰ、Ⅱ有很大差異，除了包含 HD-LZ 結(jié)構(gòu)域外，包含一個類固醇敏感的脂質(zhì)調(diào)節(jié)蛋白（START）結(jié)構(gòu)域，C 末端序列高度保守。HD-ZIP Ⅳ轉(zhuǎn)錄因子可能存在于所有的陸生植物中，相關(guān)的研究已在擬南芥[66]，向日葵[67]，棉花[56]，番茄[68]，蘋果[69]，玉米[70]，大米[71]，高粱[72]，挪威云杉[73]，石屬植物[74]，苔蘚類植物[75]等中，結(jié)果證實(shí)了 HD-ZIP Ⅳ轉(zhuǎn)錄因子活性與表皮發(fā)育和功能之間的關(guān)系。HD-ZIP Ⅳ因子與參與表皮層分化和發(fā)育的下游靶基因的啟動子區(qū)

圖 1.5 亞洲棉 sma-4(ha) 基因的遺傳和物理定位A. SMA-4 和非洲棉 1 號的莖和種子; B. 光稈和光籽基因 sma-4(ha)的遺傳定位，C. GaHD1基因在雷蒙德氏棉 scaffold 上的物理位置（蘭色線條表示）Figure1.5 Genetic and physical localization of SMA-4 (ha) in G. arboreumA.The stems and seeds of SMA-4 and African cotton 1; B. Genetic localization of sm-4 (ha) gene;C. The location of GaHD1 gene in G. raimondii genome (blue line representation)亞洲棉 SMA-4 是一個無茸毛（光稈），無纖維（光籽，即無短絨也無皮棉纖維）的天然突變體（圖 1A）[88,89]，非洲棉 1 號是一個有很密茸毛和長絨纖維的非洲棉常規(guī)品種（圖 1A）。我們課題組前期用近 3000 個由上述兩個親本雜交產(chǎn)生的 F2單株組成的大群體，對光稈光籽突變體基因（sma-4(ha)）進(jìn)行了精細(xì)定位，發(fā)現(xiàn)光稈和光籽共分離，并且被定位在 L.G.A3的中間區(qū)段（圖 1B）[90]，與先前的研究報道基本相同。通過圖位克隆和 DNA 序列分析等方法確定了 sma-4(ha)的候選基因（圖 1C），發(fā)現(xiàn)該基因?qū)儆?HD-ZIP IV 基因家族成員，是含有一個 Homebox 結(jié)構(gòu)域以及 START蛋白結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，為 GhHD1 在亞洲棉中的同源基因，命名為 GaHD1。通過野生型（亞洲棉 4 號）與突變體（SMA-4）之間 DNA 序列比對，我們發(fā)現(xiàn) SMA-4

圖 2.4.1 GaHD1 啟動子引物設(shè)計圖譜Figure 2.4.1 The primer design of GaHD1 promoter sequence2.4.2 PCR 分段擴(kuò)增 GaHD1 啟動子序列以 GaHD1 啟動子 PCR 回收產(chǎn)物為 DNA 模板，進(jìn)行 HD1 的分段克隆。具體法參照 2.2.3PCR 擴(kuò)增 GaHD1 基因啟動子全長。2.4.3 PCR 產(chǎn)物回收具體方法參照 2.2.4PCR 產(chǎn)物回收。2.5 分段克隆啟動子與 GUS 融合載體的重組及鑒定將測序反饋回來的序列與全長啟動子序列進(jìn)行比對，將比對無誤的 PCR 回收物利用核酸蛋白儀測定濃度。2.5.1 pCXSN1262 載體的準(zhǔn)備2.5.1.1 pCXSN1262 載體pCXSN1262 具有 XcmⅠ酶切位點(diǎn)，XcmⅠ酶切后產(chǎn)生一個末端 T。載體構(gòu)建圖譜
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2856634