研究背景:急性心肌梗死(AMI)是冠心病的一個(gè)重要分型。隨著社會(huì)發(fā)展和老齡化的加快,我國(guó)心血管病(CVD)的死亡率和患病率仍在快速增長(zhǎng)。其中冠狀動(dòng)脈性心臟病(CAD)在心血管病中高發(fā),絕大多數(shù)是由冠狀動(dòng)脈硬化引起的。根據(jù)流行病學(xué)研究已知,與冠狀動(dòng)脈硬化相關(guān)的重要危險(xiǎn)因子有血脂異常、高血壓、糖尿病、吸煙、肥胖、血同型半胱氨酸增高、體力活動(dòng)少、高齡和男性等。冠心病的發(fā)生與周圍環(huán)境和遺傳因素有密切相關(guān)的聯(lián)系。目前證實(shí)全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)發(fā)現(xiàn)有200多個(gè)與CAD有關(guān)的染色體基因位點(diǎn),但僅解釋了只有11%的CAD與遺傳相關(guān)。T-box基因編碼在人類中已經(jīng)鑒定出20多個(gè)基因,其中TBX5基因已經(jīng)證實(shí)與心臟發(fā)育有關(guān),同時(shí)對(duì)冠狀動(dòng)脈的形成也有一定影響�；騿�(dòng)子對(duì)轉(zhuǎn)錄水平有調(diào)控的作用,進(jìn)一步影響蛋白的翻譯及表達(dá)。本研究我們推測(cè)表觀遺傳基因TBX5在AMI的發(fā)病機(jī)制中存在重要作用,通過(guò)對(duì)TBX5基因啟動(dòng)子的研究,探討TBX5基因在轉(zhuǎn)錄水平上與AMI發(fā)生的關(guān)系。研究目的:通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)冠心病的發(fā)生與基因遺傳有密切關(guān)系。使用生物信息學(xué)方法來(lái)預(yù)測(cè)分析TBX5基因啟動(dòng)子區(qū),通過(guò)設(shè)計(jì)引物克隆鑒定TBX5基因啟動(dòng)子。然后測(cè)序發(fā)現(xiàn)遺傳變異位點(diǎn),在此基礎(chǔ)上,構(gòu)建TBX5基因啟動(dòng)子野生型和遺傳位點(diǎn)啟動(dòng)子的pGL3-basic報(bào)告基因載體,探討遺傳變異對(duì)轉(zhuǎn)錄水平的活性影響。然后運(yùn)用EMSA實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)一步探討有轉(zhuǎn)錄水平影響的遺傳變異對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的改變。本研究對(duì)TBX5基因啟動(dòng)子的遺傳和功能變異提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究方法:1、本實(shí)驗(yàn)納入新發(fā)AMI患者432例、同時(shí)間段健康體檢人群448例,錄入兩組人群的臨床基線資料,收集所有樣本的外周血并提取全基因組。2、采用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)TBX5基因啟動(dòng)子,根據(jù)NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)提供的序列設(shè)計(jì)引物,用PCR方法擴(kuò)增基因啟動(dòng)子,擴(kuò)增產(chǎn)物送往公司測(cè)序后統(tǒng)計(jì)分析變異序列位點(diǎn)結(jié)果。3、將統(tǒng)計(jì)的具有TBX5基因啟動(dòng)子的變異序列位點(diǎn)及野生型目的基因片段構(gòu)建pGL3-basic雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒,經(jīng)測(cè)序鑒定后,將pGL3-basic雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒和內(nèi)參pRL-TK質(zhì)粒利用脂質(zhì)體瞬轉(zhuǎn)至HEK293細(xì)胞、H9c2心肌細(xì)胞。使用雙熒光報(bào)告基因分析儀檢測(cè)報(bào)告基因表達(dá)產(chǎn)物雙熒光素酶的活性,以鑒定TBX5基因啟動(dòng)子變異序列對(duì)轉(zhuǎn)錄活性的影響。4、在對(duì)具有轉(zhuǎn)錄活性有影響的基因啟動(dòng)子變異序列位點(diǎn)做進(jìn)一步探討,采用凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn)方法(EMSA),通過(guò)設(shè)計(jì)野生型和具有序列變異位點(diǎn)的目的基因設(shè)計(jì)探針,驗(yàn)證是否轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生變化,從而發(fā)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的影響。研究結(jié)果:1、AMI組患者的年齡比正常對(duì)照組年齡要高,同時(shí)男性患病率更高。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn),AMI組甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)和低密度脂蛋白(LDL-C)數(shù)值與正常對(duì)照組,P0.001差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),AMI組的患者具有吸煙史、糖尿病史和高血壓病史的比例高于正常對(duì)照組,P0.01差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2、經(jīng)PCR擴(kuò)增后測(cè)序發(fā)現(xiàn)14個(gè)DSVs,其中包括6個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNPs)。在AMI組中發(fā)現(xiàn)了 6個(gè)雜合DSVs,2個(gè)為SNPs:g.114408439GT(rs186960328)、g.114408862AG、g.114409193TC、g.114409076CA、g.114409249AG(rs564965932)和 g.114409343GA。未在正常對(duì)照組中發(fā)現(xiàn)以上變異位點(diǎn)。在正常對(duì)照組人群中發(fā)現(xiàn)4個(gè)新的DSVs,其中2個(gè)雜合 DSVs:g.114408539TC、g.114409294AG,一個(gè)雜合缺失 DSV:g.114408344delC,一個(gè)雜合插入 DSV:g.114408458insTAATAA。尚未在 AMI 患者中出現(xiàn)。在AMI組和正常對(duì)照組里同時(shí)發(fā)現(xiàn)了 4個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNPs):g.114408635(rs57820630)GA、g.114409208(rs183776658)GA、g.114409331(rs7957609)CT 和 g.114409337(rs79795050)GC。同時(shí)把兩組間發(fā)生的頻率做比較,其發(fā)生頻率相似,沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3、構(gòu)建TBX5基因啟動(dòng)子pGL3-basic雙熒光報(bào)告基因載體,分別為pGL3-WT(野生型)、pGL3-114408439T、pGL3-114408862G、pGL3-114409193C、pGL3-114409076A、pGL3-114409249A、pGL3-114409343G、pGL3-114409294C、pGL3-114408344delC、pGL3-114408458insTAATAA、pGL3-114409208A(rs183776658)。經(jīng)測(cè)序鑒定,其插入變異序列正確,成功構(gòu)建重組質(zhì)粒。4、利用脂質(zhì)體瞬轉(zhuǎn)到人胚腎細(xì)胞系(HEK293)和大鼠心肌細(xì)胞系(H9c2)上。轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,在AMI組中發(fā)現(xiàn)3個(gè)DSVs可顯著影響TBX5基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。DSVs g.114409193TC(P0.01)能顯著降低TBX5基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性;DSVs g.114408862AG(P0.01)、g.114409076CA(P0.01)可以增加TBX5基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。在對(duì)照組中發(fā)現(xiàn)的DSVs:g.114408334delC、g.114408458insTAATAA、g.114409294AG,沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其改變 TBX5 基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性(P0.05)。同時(shí)在AMI和對(duì)照組中DSVs g.114409208GA(rs183776658)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其改變啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞檢測(cè)DSVs的相對(duì)轉(zhuǎn)錄活性。在AMI中發(fā)現(xiàn)DSVs:g.114409193TC(P0.01)、g.114408862AG(P0.01)、g.114409076CA(P0.01)、g.114409249GA(rs564965932)(P0.01)、g.114409343AG(P0.05)都可以顯著降低TBX5基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。同樣在正常對(duì)照組人群中發(fā)現(xiàn)的DSVs的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示DSVsg.114408862中野生型探針中出現(xiàn)了明顯的與蛋白結(jié)合形成的特異性條帶,但標(biāo)記的突變型探針中其特異性條帶消失,其余DSVs未檢出。我們推測(cè)TBX5基因啟動(dòng)子DSVs g.114408862改變了其原先的轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)。研究結(jié)論:通過(guò)對(duì)TBX5基因啟動(dòng)子的遺傳和功能性變異的研究,在AMI病人中發(fā)現(xiàn)序列變異位點(diǎn)對(duì)TBX5的轉(zhuǎn)錄活性和轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)的結(jié)合可能會(huì)有影響,進(jìn)而會(huì)導(dǎo)致其表達(dá)水平的變化,對(duì)進(jìn)一步研究心肌梗死的發(fā)生提供了新的方向,同時(shí)為心肌梗死的治療提供了潛在靶點(diǎn)。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R542.22
【部分圖文】：

１２３４５６７８９????７５０ｂｐ??圖１－２?ＴＢＸ５基因啟動(dòng)子ＰＣＲ擴(kuò)增片段２?（６８８ｂｐ）。泳道９是Ｄ２０００?ｍａｋｅｒ，??泳道１？８是ＴＢＸ５基因啟動(dòng)子片段２的部分?jǐn)U增產(chǎn)物。??ｇ．１１４４０８４５８ｉｎｓＴＡＡＴＡＡ??Ｓ．１１４４〇９２４９Ｇ＞Ａ?ｇ，１４４０８５３９Ｔ＞Ｃ??ｇ．１１４４０９３３７Ｃ＞Ｇ?ｇ．１１４４０９２０８Ｇ＞Ａ?ｎ?１１４４ｎＲ＾４Ｈｆｉｉｒ??ｇ．１１４４０８６３５Ｇ＞Ａ?ｇ．１１４４０８３３４ｄｅｌＣ??ｇ．１１４４０９１９３Ｔ＞Ｃ??ｇ．１１４４０８８６２Ａ＞Ｇ??ｊ??ｊ?ｉ?Ｌ?ｉ?ｊ??－８００?－６００?－４〇〇?－２〇〇?—??Ｅｘ〇ｎ１??ｇ．１１４４０９３４３Ａ＞Ｇ??ｇ．１１４４０９３３１Ｔ＞Ｃ?ｇ．１１４４０９０７６Ｃ＞Ａ?ｇ．１１４４０８４３９Ｇ＞Ｔ??ｇ．１１４４０９２９４Ａ＞Ｇ??圖２正常對(duì)照組和ＡＭＩ組的ＴＢＸ５基因（ＮＣＢＩ收錄號(hào)：ＮＣ＿００００１２．１２）啟動(dòng)??子的ＤＳＶｓ位置。ＴＳＳ位于第一外顯子起始位點(diǎn)ｇ．?１１４４０８４４１?（＋１）。??５３??

ＲＨＰＨＩＨＰＷＨＢＳ????７５０ｂｐ??圖１－１?ＴＢＸ５基因啟動(dòng)子ＰＣＲ擴(kuò)增片段１?（６６７ｂｐ）。泳道９是Ｄ２０００?ｍａｋｅｒ，??泳道１？８是ＴＢＸ５基因啟動(dòng)子片段１的部分?jǐn)U增產(chǎn)物。??１２３４５６７８９????７５０ｂｐ??圖１－２?ＴＢＸ５基因啟動(dòng)子ＰＣＲ擴(kuò)增片段２?（６８８ｂｐ）。泳道９是Ｄ２０００?ｍａｋｅｒ，??泳道１？８是ＴＢＸ５基因啟動(dòng)子片段２的部分?jǐn)U增產(chǎn)物。??ｇ．１１４４０８４５８ｉｎｓＴＡＡＴＡＡ??Ｓ．１１４４〇９２４９Ｇ＞Ａ?ｇ，１４４０８５３９Ｔ＞Ｃ??ｇ．１１４４０９３３７Ｃ＞Ｇ?ｇ．１１４４０９２０８Ｇ＞Ａ?ｎ?１１４４ｎＲ＾４Ｈｆｉｉｒ??ｇ．１１４４０８６３５Ｇ＞Ａ?ｇ．１１４４０８３３４ｄｅｌＣ??ｇ．１１４４０９１９３Ｔ＞Ｃ??ｇ．１１４４０８８６２Ａ＞Ｇ??ｊ??ｊ?ｉ?Ｌ?ｉ?ｊ??－８００?－６００?－４〇〇?－２〇〇?—??Ｅｘ〇ｎ１??ｇ．１１４４０９３４３Ａ＞Ｇ??ｇ．１１４４０９３３１Ｔ＞Ｃ?ｇ．１１４４０９０７６Ｃ＞Ａ?ｇ．１１４４０８４３９Ｇ＞Ｔ??ｇ．１１４４０９２９４Ａ＞Ｇ??圖２正常對(duì)照組和ＡＭＩ組的ＴＢＸ５基因（ＮＣＢＩ收錄號(hào)：ＮＣ＿００００１２．１２）啟動(dòng)??子的ＤＳＶｓ位置。ＴＳＳ位于第一外顯子起始位點(diǎn)ｇ．?１１４４０８４４１?（＋１）。??５３??

圖２正常對(duì)照組和ＡＭＩ組的ＴＢＸ５基因（ＮＣＢＩ收錄號(hào)：ＮＣ＿００００１２．１２）啟動(dòng)??子的ＤＳＶｓ位置。ＴＳＳ位于第一外顯子起始位點(diǎn)ｇ．?１１４４０８４４１?（＋１）。??
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 楊英;魯向鋒;;冠心病全基因組關(guān)聯(lián)研究進(jìn)展[J];遺傳;2010年02期

本文編號(hào)：2855115