研究背景:急性心肌梗死(AMI)是冠心病的一個重要分型。隨著社會發(fā)展和老齡化的加快,我國心血管病(CVD)的死亡率和患病率仍在快速增長。其中冠狀動脈性心臟病(CAD)在心血管病中高發(fā),絕大多數(shù)是由冠狀動脈硬化引起的。根據(jù)流行病學研究已知,與冠狀動脈硬化相關的重要危險因子有血脂異常、高血壓、糖尿病、吸煙、肥胖、血同型半胱氨酸增高、體力活動少、高齡和男性等。冠心病的發(fā)生與周圍環(huán)境和遺傳因素有密切相關的聯(lián)系。目前證實全基因組關聯(lián)研究(GWAS)發(fā)現(xiàn)有200多個與CAD有關的染色體基因位點,但僅解釋了只有11%的CAD與遺傳相關。T-box基因編碼在人類中已經(jīng)鑒定出20多個基因,其中TBX5基因已經(jīng)證實與心臟發(fā)育有關,同時對冠狀動脈的形成也有一定影響�；騿幼訉D(zhuǎn)錄水平有調(diào)控的作用,進一步影響蛋白的翻譯及表達。本研究我們推測表觀遺傳基因TBX5在AMI的發(fā)病機制中存在重要作用,通過對TBX5基因啟動子的研究,探討TBX5基因在轉(zhuǎn)錄水平上與AMI發(fā)生的關系。研究目的:通過分析發(fā)現(xiàn)冠心病的發(fā)生與基因遺傳有密切關系。使用生物信息學方法來預測分析TBX5基因啟動子區(qū),通過設計引物克隆鑒定TBX5基因啟動子。然后測序發(fā)現(xiàn)遺傳變異位點,在此基礎上,構(gòu)建TBX5基因啟動子野生型和遺傳位點啟動子的pGL3-basic報告基因載體,探討遺傳變異對轉(zhuǎn)錄水平的活性影響。然后運用EMSA實驗方法進一步探討有轉(zhuǎn)錄水平影響的遺傳變異對轉(zhuǎn)錄調(diào)控的改變。本研究對TBX5基因啟動子的遺傳和功能變異提供了重要的實驗依據(jù)。研究方法:1、本實驗納入新發(fā)AMI患者432例、同時間段健康體檢人群448例,錄入兩組人群的臨床基線資料,收集所有樣本的外周血并提取全基因組。2、采用生物信息學預測TBX5基因啟動子,根據(jù)NCBI基因數(shù)據(jù)庫提供的序列設計引物,用PCR方法擴增基因啟動子,擴增產(chǎn)物送往公司測序后統(tǒng)計分析變異序列位點結(jié)果。3、將統(tǒng)計的具有TBX5基因啟動子的變異序列位點及野生型目的基因片段構(gòu)建pGL3-basic雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒,經(jīng)測序鑒定后,將pGL3-basic雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒和內(nèi)參pRL-TK質(zhì)粒利用脂質(zhì)體瞬轉(zhuǎn)至HEK293細胞、H9c2心肌細胞。使用雙熒光報告基因分析儀檢測報告基因表達產(chǎn)物雙熒光素酶的活性,以鑒定TBX5基因啟動子變異序列對轉(zhuǎn)錄活性的影響。4、在對具有轉(zhuǎn)錄活性有影響的基因啟動子變異序列位點做進一步探討,采用凝膠電泳遷移實驗方法(EMSA),通過設計野生型和具有序列變異位點的目的基因設計探針,驗證是否轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生變化,從而發(fā)現(xiàn)對轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的影響。研究結(jié)果:1、AMI組患者的年齡比正常對照組年齡要高,同時男性患病率更高。通過對比發(fā)現(xiàn),AMI組甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)和低密度脂蛋白(LDL-C)數(shù)值與正常對照組,P0.001差異有統(tǒng)計學意義。根據(jù)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),AMI組的患者具有吸煙史、糖尿病史和高血壓病史的比例高于正常對照組,P0.01差異具有統(tǒng)計學意義。2、經(jīng)PCR擴增后測序發(fā)現(xiàn)14個DSVs,其中包括6個單核苷酸多態(tài)性位點(SNPs)。在AMI組中發(fā)現(xiàn)了 6個雜合DSVs,2個為SNPs:g.114408439GT(rs186960328)、g.114408862AG、g.114409193TC、g.114409076CA、g.114409249AG(rs564965932)和 g.114409343GA。未在正常對照組中發(fā)現(xiàn)以上變異位點。在正常對照組人群中發(fā)現(xiàn)4個新的DSVs,其中2個雜合 DSVs:g.114408539TC、g.114409294AG,一個雜合缺失 DSV:g.114408344delC,一個雜合插入 DSV:g.114408458insTAATAA。尚未在 AMI 患者中出現(xiàn)。在AMI組和正常對照組里同時發(fā)現(xiàn)了 4個單核苷酸多態(tài)性位點(SNPs):g.114408635(rs57820630)GA、g.114409208(rs183776658)GA、g.114409331(rs7957609)CT 和 g.114409337(rs79795050)GC。同時把兩組間發(fā)生的頻率做比較,其發(fā)生頻率相似,沒有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3、構(gòu)建TBX5基因啟動子pGL3-basic雙熒光報告基因載體,分別為pGL3-WT(野生型)、pGL3-114408439T、pGL3-114408862G、pGL3-114409193C、pGL3-114409076A、pGL3-114409249A、pGL3-114409343G、pGL3-114409294C、pGL3-114408344delC、pGL3-114408458insTAATAA、pGL3-114409208A(rs183776658)。經(jīng)測序鑒定,其插入變異序列正確,成功構(gòu)建重組質(zhì)粒。4、利用脂質(zhì)體瞬轉(zhuǎn)到人胚腎細胞系(HEK293)和大鼠心肌細胞系(H9c2)上。轉(zhuǎn)染HEK293細胞,在AMI組中發(fā)現(xiàn)3個DSVs可顯著影響TBX5基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。DSVs g.114409193TC(P0.01)能顯著降低TBX5基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性;DSVs g.114408862AG(P0.01)、g.114409076CA(P0.01)可以增加TBX5基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。在對照組中發(fā)現(xiàn)的DSVs:g.114408334delC、g.114408458insTAATAA、g.114409294AG,沒有發(fā)現(xiàn)其改變 TBX5 基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性(P0.05)。同時在AMI和對照組中DSVs g.114409208GA(rs183776658)沒有發(fā)現(xiàn)其改變啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。轉(zhuǎn)染H9c2細胞檢測DSVs的相對轉(zhuǎn)錄活性。在AMI中發(fā)現(xiàn)DSVs:g.114409193TC(P0.01)、g.114408862AG(P0.01)、g.114409076CA(P0.01)、g.114409249GA(rs564965932)(P0.01)、g.114409343AG(P0.05)都可以顯著降低TBX5基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。同樣在正常對照組人群中發(fā)現(xiàn)的DSVs的差異沒有統(tǒng)計學意義(P0.05)。EMSA實驗結(jié)果顯示DSVsg.114408862中野生型探針中出現(xiàn)了明顯的與蛋白結(jié)合形成的特異性條帶,但標記的突變型探針中其特異性條帶消失,其余DSVs未檢出。我們推測TBX5基因啟動子DSVs g.114408862改變了其原先的轉(zhuǎn)錄位點。研究結(jié)論:通過對TBX5基因啟動子的遺傳和功能性變異的研究,在AMI病人中發(fā)現(xiàn)序列變異位點對TBX5的轉(zhuǎn)錄活性和轉(zhuǎn)錄位點的結(jié)合可能會有影響,進而會導致其表達水平的變化,對進一步研究心肌梗死的發(fā)生提供了新的方向,同時為心肌梗死的治療提供了潛在靶點。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R542.22
【部分圖文】：

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【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 楊英;魯向鋒;;冠心病全基因組關聯(lián)研究進展[J];遺傳;2010年02期

本文編號：2855115