重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-type ATPase(HMA)已被證實(shí)參與植物體內(nèi)的重金屬運(yùn)輸,HMA5主要參與銅的轉(zhuǎn)運(yùn)。在模式植物擬南芥、水稻和黃瓜中對(duì)HMA5基因進(jìn)行了較多的研究,但是對(duì)豆科植物HMA5的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。實(shí)驗(yàn)室前期在天藍(lán)苜蓿中分離到一個(gè)與銅脅迫及共生結(jié)瘤相關(guān)的HMA5基因,為了對(duì)此類基因在豆科植物共生結(jié)瘤中的作用進(jìn)行深入研究,本研究對(duì)全基因組已測(cè)序的模式豆科植物蒺藜苜蓿的基因組進(jìn)行篩查,尋找HMA5同源基因并通過(guò)表達(dá)模式分析初步判斷其與共生結(jié)瘤的關(guān)系,在此基礎(chǔ)上,以其中的MTR_8g079250基因?yàn)閷?duì)象,進(jìn)行亞細(xì)胞定位、組織表達(dá)、RNA干擾和過(guò)量表達(dá)等研究,初步鑒定該基因在共生結(jié)瘤中的功能。1、MTR_8g079250的亞細(xì)胞定位構(gòu)建MTR_8g079250的洋蔥表皮亞細(xì)胞定位載體,通過(guò)基因槍轟擊轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞,在激光共聚焦顯微鏡下觀察到MTR_8g079250::GFP融合蛋白主要在細(xì)胞膜上表達(dá),在細(xì)胞核上也有微量的表達(dá);構(gòu)建MTR_8g079250的煙草葉片亞細(xì)胞定位載體,通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)注射煙草葉片的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)化,結(jié)果表明目的基因主要定位在細(xì)胞膜和細(xì)胞核上;2、MTR_8g079250的組織表達(dá)構(gòu)建PMTR_8g079250::GUS融合表達(dá)載體,通過(guò)農(nóng)桿菌發(fā)根轉(zhuǎn)化的方式轉(zhuǎn)入蒺藜苜蓿根部,經(jīng)培養(yǎng)后,進(jìn)行GUS染色觀察。結(jié)果表明目的基因主要在蒺藜苜蓿根瘤的分生區(qū)、侵染區(qū)以及皮層表達(dá),在根的中柱和根冠表達(dá)。3、MTR_8g079250基因RNA干擾和過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)化植株的生長(zhǎng)及結(jié)瘤情況分析構(gòu)建目的基因的RNA干擾載體和過(guò)量表達(dá)載體,通過(guò)農(nóng)桿菌發(fā)根轉(zhuǎn)化的方式轉(zhuǎn)入蒺藜苜蓿根部,形成轉(zhuǎn)基因的嵌合植株。分別從根瘤菌的侵染事件、植株的形態(tài)生理指標(biāo)、根瘤的顯微結(jié)構(gòu)和相關(guān)基因的時(shí)空表達(dá)等方面進(jìn)行分析,RNA干擾轉(zhuǎn)化植株在以上幾個(gè)方面與對(duì)照組植株無(wú)明顯差異,表明目的基因干擾后對(duì)根瘤菌的共生固氮沒(méi)有產(chǎn)生明顯影響。過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)化植株在根瘤菌侵染過(guò)程中形成的皮層侵染線和根瘤原基數(shù)目顯著減少,植株鮮重和根瘤數(shù)目較對(duì)照組明顯降低;透射電鏡結(jié)果顯示,根瘤受侵染細(xì)胞中類菌體數(shù)目減少,形狀不規(guī)則,環(huán)類菌體空間增大,呈現(xiàn)出衰老的跡象;qRT-PCR分析表明,結(jié)瘤標(biāo)志性基因NIN、DMI1和ENOD11的表達(dá)水平均有不同程度的下調(diào),豆血紅蛋白基因的表達(dá)水平也有所下調(diào),蒺藜苜蓿HMA5另外兩個(gè)同源基因MTR_5g010420和MTR_8g012390變化水平較小,HMA7/RAN1同源基因MTR_2g035840的表達(dá)水平顯著上調(diào),另一個(gè)基因MTR_4g094695的表達(dá)水平則無(wú)明顯變化。CCH同源基因的表達(dá)水平無(wú)明顯變化。綜上所述,推測(cè)MTR_8g079250過(guò)量表達(dá)對(duì)共生結(jié)瘤有抑制作用,同時(shí)影響了植物的生長(zhǎng)。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：Q943.2
【部分圖文】：

結(jié)瘤因子誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（以豆科模式植物為例）（丑敏霞Signaling transduction pathways induced by nod factor (with M.trunc中 屬離子的轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)于根瘤中金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)的研究已開(kāi)展，對(duì)于 Fe 的轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)于其他金屬，例如 Mo、Ni 和 Cu 的研究還處于初級(jí)階主要通過(guò)維管組織進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn) (Gonzálezguerrero et al. 2016S-XRF 技術(shù)對(duì)根瘤不同發(fā)育階段鐵離子的分布研究，結(jié)果有檢測(cè)到鐵離子；在侵染區(qū)，鐵離子積累在質(zhì)外體中；固中；在衰亡區(qū)，侵染細(xì)胞中的鐵離子濃度較固氮區(qū)侵染細(xì)微管組織中。根瘤的侵染區(qū)存在 Fe2+的轉(zhuǎn)運(yùn)體(Tejada-Jim有可能是通過(guò)檸檬酸鹽進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)(Takanashi et al. 2013)。tNramp1 負(fù)責(zé)將鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)到侵染區(qū)細(xì)胞，并且 MtNram(Tejada-Jiménez et al. 2015)。根瘤中金屬穿過(guò)共生體膜后終這些金屬會(huì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)以發(fā)揮功能。Mo 是以鉬酸根中(Cheng et al. 2016)。成熟根瘤中的氫化酶需要 Ni2+作為

12 蒺藜苜蓿 HMA5 基因在共生固氮過(guò)程中的功能研究2.4 結(jié)果與分析2.4.1 系統(tǒng)發(fā)育分析以目前分類明確的 HMA 家族基因?yàn)橐罁?jù)，對(duì)蒺藜苜蓿中的相關(guān)基因進(jìn)行系統(tǒng)分析。選用系統(tǒng)進(jìn)化分析軟件 MEGA6，用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果如所示。從圖中可以看出蒺藜苜蓿中的 MTR_8g079250、MTR_5g010420 和 MTR_8g0與其他物種的 HMA5 家族基因相似性最高，預(yù)測(cè)這三個(gè)基因?qū)儆谳疝架俎?HMA5

第二章 基因的選取及時(shí)空表達(dá)分析 13升高；MTR_5g010420 表達(dá)較穩(wěn)定，其轉(zhuǎn)錄水平受到接種根瘤菌的顯著誘導(dǎo)，接菌后 28d的表達(dá)量最高；MTR_8g012390 表達(dá)量在中期較高，接菌后 10d 達(dá)到峰值，但與未接種對(duì)照相比沒(méi)有太大差異，只在接菌后 28d 時(shí)表達(dá)量較不接菌植株顯著上調(diào)。根據(jù)以上結(jié)果分析，MTR_5g010420 和 MTR_8g079250 接菌后的表達(dá)量上調(diào)明顯，預(yù)測(cè)與共生相關(guān)。
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 丑敏霞;魏新元;;豆科植物共生結(jié)瘤的分子基礎(chǔ)和調(diào)控研究進(jìn)展[J];植物生態(tài)學(xué)報(bào);2010年07期

2 趙艷;徐迎春;柴翠翠;周燕;;銅脅迫對(duì)狹葉香蒲生長(zhǎng)及生理特性的影響[J];廣西植物;2010年03期

本文編號(hào)：2855211