甜瓜(Cucumis melo L.)為一年生匍匐或攀援草本植物,是重要的園藝經(jīng)濟(jì)作物,在世界上廣泛栽培,它具有獨(dú)特的生物特性和重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。甜瓜是除了番茄之外另一種可選擇且非常重要的研究肉質(zhì)型果實(shí)發(fā)育的模式植物,乙烯在其果實(shí)發(fā)育成熟中存在著明顯的變化。ACC合成酶(1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合成酶,ACS)是乙烯生物合成過程中催化S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)的關(guān)鍵限速酶。以甜瓜品種河套蜜瓜(Cucumis melo L.cv.Hetao)為實(shí)驗(yàn)材料,應(yīng)用生物信息學(xué)的方法從其基因組數(shù)據(jù)庫中鑒定篩選出ACS基因家族的全部成員,共鑒定得到11個(gè)甜瓜ACS基因。內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)生與進(jìn)化關(guān)系分析結(jié)果表明,甜瓜ACS基因中,CmACS1和CmACS2屬于Ⅰ型,CmACS7、CmACS10、CmACS11和CmACS12屬于Ⅱ型,CmACS3和CmACS5屬于Ⅲ型。啟動(dòng)子預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,甜瓜ACS基因啟動(dòng)子序列中,主要含有參與防御和脅迫響應(yīng)的順式作用元件和參與響應(yīng)各種激素的順式調(diào)控元件。半定量和實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)結(jié)果表明,甜瓜ACS基因表達(dá)具有組織特異性,CmACS1和CmACS11在果實(shí)躍變期表達(dá)量升高,CmACS10和CmACS12在葉中表達(dá)量較高,CmACS7和CmACS11在子房中表達(dá)量均相對(duì)較高。應(yīng)用RT-PCR法克隆了CmACS7和CmACS11基因全長cDNA,并分別構(gòu)建CmACS7、CmACS11和實(shí)驗(yàn)室已克隆基因CmACS1的超表達(dá)載體和CRISPR/Cas9基因編輯載體。應(yīng)用子房注射法轉(zhuǎn)化甜瓜,PCR檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)化效率為12.5%-57%。通過測(cè)序分析,編輯載體pCRI-CmACS1、pCRI-CmACS7轉(zhuǎn)化的陽性植株沒有發(fā)生基因編輯,pCRI-CmACS11、pCRI-CmACS1/11和pCRI-CmACS7/11轉(zhuǎn)化的陽性植株共有11株發(fā)生了基因編輯。
【學(xué)位單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：Q943.2;S652
【文章目錄】：
摘要
abstract
一 引言
    1.1 甜瓜簡(jiǎn)介
        1.1.1 甜瓜的基本特性
        1.1.2 甜瓜基因組學(xué)研究進(jìn)展
    1.2 ACC合成酶的研究進(jìn)展
        1.2.1 ACC合成酶的生化特性及結(jié)構(gòu)特征
        1.2.2 植物ACC合成酶進(jìn)化分析
        1.2.3 植物ACC合成酶功能的研究進(jìn)展
    1.3 基因組編輯技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用前景
        1.3.1 基因組編輯技術(shù)概述
        1.3.2 基因組編輯技術(shù)的發(fā)展歷程
    1.4 CRISPR/Cas系統(tǒng)概述
        1.4.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的研究歷史
        1.4.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的分類
        1.4.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的工作原理
        1.4.4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物中的研究進(jìn)展
    1.5 本研究目的及意義
二 材料和方法
    2.1 材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 菌種與質(zhì)粒
    2.2 方法
        2.2.1 甜瓜ACS基因家族成員的鑒定
        2.2.2 生物信息學(xué)分析
        2.2.3 ACS基因家族成員的表達(dá)特性分析
        2.2.4 CmACS7和CmACS11基因全長cDNA的RT-PCR擴(kuò)增
        2.2.5 連接及轉(zhuǎn)化
        2.2.6 CRISPR-Cas9載體的構(gòu)建
        2.2.7 超表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.2.8 甜瓜的遺傳轉(zhuǎn)化
1代轉(zhuǎn)化植株的檢測(cè)'>        2.2.9 T₁代轉(zhuǎn)化植株的檢測(cè)
三 結(jié)果與分析
    3.1 甜瓜ACS基因家族成員的鑒定與分析
        3.1.1 序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)生分析
        3.1.2 甜瓜ACS基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)分析
        3.1.3 甜瓜ACS基因家族啟動(dòng)子序列分析
    3.2 ACS基因家族成員的表達(dá)特性分析
    3.3 CmACS7和CmACS11基因全長cDNA的克隆
    3.4 基因編輯載體的構(gòu)建
        3.4.1 基因組靶位點(diǎn)選擇和接頭引物設(shè)計(jì)
        3.4.2 gRNA表達(dá)盒的構(gòu)建
        3.4.3 pCRI-ACS重組質(zhì)粒的篩選
    3.5 超表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.5.1 重組質(zhì)粒的PCR鑒定
        3.5.2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定
    3.6 ACS基因遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè)
        3.6.1 甜瓜的遺傳轉(zhuǎn)化
1代轉(zhuǎn)化植株的檢測(cè)'>        3.6.2 T₁代轉(zhuǎn)化植株的檢測(cè)
四 討論
    4.1 ACS基因家族成員的鑒定與分析
    4.2 CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)CmACS7和CmACS11基因的初步應(yīng)用
五 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
在讀期間發(fā)表論文情況
致謝
附錄

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉婷婷;范迪;冉玲玉;姜淵忠;劉瑞;羅克明;;應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)在楊樹中高效敲除多個(gè)靶基因[J];遺傳;2015年10期

2 Wenshan Liu;Xiaohong Zhu;Mingguang Lei;Qingyou Xia;Jose Ramon Botella;Jian-Kang Zhu;Yanfei Mao;;A detailed procedure for CRISPR/Cas9-mediated gene editing in Arabidopsis thaliana[J];Science Bulletin;2015年15期

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本文編號(hào)：2854389