甜瓜(Cucumis melo L.)為一年生匍匐或攀援草本植物,是重要的園藝經濟作物,在世界上廣泛栽培,它具有獨特的生物特性和重要的經濟價值。甜瓜是除了番茄之外另一種可選擇且非常重要的研究肉質型果實發(fā)育的模式植物,乙烯在其果實發(fā)育成熟中存在著明顯的變化。ACC合成酶(1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合成酶,ACS)是乙烯生物合成過程中催化S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)的關鍵限速酶。以甜瓜品種河套蜜瓜(Cucumis melo L.cv.Hetao)為實驗材料,應用生物信息學的方法從其基因組數據庫中鑒定篩選出ACS基因家族的全部成員,共鑒定得到11個甜瓜ACS基因。內含子-外顯子結構和系統(tǒng)發(fā)生與進化關系分析結果表明,甜瓜ACS基因中,CmACS1和CmACS2屬于Ⅰ型,CmACS7、CmACS10、CmACS11和CmACS12屬于Ⅱ型,CmACS3和CmACS5屬于Ⅲ型。啟動子預測結果顯示,甜瓜ACS基因啟動子序列中,主要含有參與防御和脅迫響應的順式作用元件和參與響應各種激素的順式調控元件。半定量和實時熒光定量檢測結果表明,甜瓜ACS基因表達具有組織特異性,CmACS1和CmACS11在果實躍變期表達量升高,CmACS10和CmACS12在葉中表達量較高,CmACS7和CmACS11在子房中表達量均相對較高。應用RT-PCR法克隆了CmACS7和CmACS11基因全長cDNA,并分別構建CmACS7、CmACS11和實驗室已克隆基因CmACS1的超表達載體和CRISPR/Cas9基因編輯載體。應用子房注射法轉化甜瓜,PCR檢測顯示轉化效率為12.5%-57%。通過測序分析,編輯載體pCRI-CmACS1、pCRI-CmACS7轉化的陽性植株沒有發(fā)生基因編輯,pCRI-CmACS11、pCRI-CmACS1/11和pCRI-CmACS7/11轉化的陽性植株共有11株發(fā)生了基因編輯。
【學位單位】：內蒙古大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：Q943.2;S652
【文章目錄】：
摘要
abstract
一 引言
    1.1 甜瓜簡介
        1.1.1 甜瓜的基本特性
        1.1.2 甜瓜基因組學研究進展
    1.2 ACC合成酶的研究進展
        1.2.1 ACC合成酶的生化特性及結構特征
        1.2.2 植物ACC合成酶進化分析
        1.2.3 植物ACC合成酶功能的研究進展
    1.3 基因組編輯技術的發(fā)展及應用前景
        1.3.1 基因組編輯技術概述
        1.3.2 基因組編輯技術的發(fā)展歷程
    1.4 CRISPR/Cas系統(tǒng)概述
        1.4.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的研究歷史
        1.4.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的分類
        1.4.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的工作原理
        1.4.4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物中的研究進展
    1.5 本研究目的及意義
二 材料和方法
    2.1 材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 菌種與質粒
    2.2 方法
        2.2.1 甜瓜ACS基因家族成員的鑒定
        2.2.2 生物信息學分析
        2.2.3 ACS基因家族成員的表達特性分析
        2.2.4 CmACS7和CmACS11基因全長cDNA的RT-PCR擴增
        2.2.5 連接及轉化
        2.2.6 CRISPR-Cas9載體的構建
        2.2.7 超表達載體的構建
        2.2.8 甜瓜的遺傳轉化
1代轉化植株的檢測'>        2.2.9 T₁代轉化植株的檢測
三 結果與分析
    3.1 甜瓜ACS基因家族成員的鑒定與分析
        3.1.1 序列比對及系統(tǒng)發(fā)生分析
        3.1.2 甜瓜ACS基因家族成員的基因結構分析
        3.1.3 甜瓜ACS基因家族啟動子序列分析
    3.2 ACS基因家族成員的表達特性分析
    3.3 CmACS7和CmACS11基因全長cDNA的克隆
    3.4 基因編輯載體的構建
        3.4.1 基因組靶位點選擇和接頭引物設計
        3.4.2 gRNA表達盒的構建
        3.4.3 pCRI-ACS重組質粒的篩選
    3.5 超表達載體的構建
        3.5.1 重組質粒的PCR鑒定
        3.5.2 重組質粒的酶切鑒定
    3.6 ACS基因遺傳轉化及轉基因植株檢測
        3.6.1 甜瓜的遺傳轉化
1代轉化植株的檢測'>        3.6.2 T₁代轉化植株的檢測
四 討論
    4.1 ACS基因家族成員的鑒定與分析
    4.2 CRISPR/Cas9技術對CmACS7和CmACS11基因的初步應用
五 結論
參考文獻
在讀期間發(fā)表論文情況
致謝
附錄

【參考文獻】

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本文編號：2854389