鳳梨草莓(Fragaria×ananassa Duch.)是薔薇科多年生草本植物,果實顏色鮮艷,果肉鮮美,營養(yǎng)豐富,深受消費者的喜愛。草莓果實中含有大量黃酮類物質(zhì),其中花青素是一種重要的水溶性色素,賦予草莓果實和葉柄鮮艷的顏色�；ㄇ嗨卦趦�(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成,在液泡中積累�；ㄇ嗨睾铣赏緩揭呀�(jīng)較為清楚,而其轉(zhuǎn)運機制卻研究較少。本課題組通過ENU誘變白果森林草莓YW5AF7,獲得一個葉柄花青素顯著下降的突變體。本研究主要以此突變體和三種森林草莓野生型YW5AF7,Ruegen,H4為材料,通過遺傳學分析、全基因組重測序、進化樹分析、瞬時轉(zhuǎn)化、穩(wěn)定轉(zhuǎn)化、表達模式分析等方法對致突變基因進行克隆和功能解析,首次報道了草莓中介導花青素轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵基因,具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。主要結(jié)果如下:1.通過ENU誘變獲得一棵突變體,其葉柄和葉片花青素含量顯著下降,命名為Reduced Anthocyanins in Petioles(rap)。野生型YW5AF7葉柄表面和維管束周圍呈紅色,而rap葉柄中相同部位沒有紅色色素的積累。與野生型相比,突變體葉柄中的總花青素含量顯著下降,與表型觀察一致。創(chuàng)建rap與YW5AF7回交F2代群體,其野生型與突變體植株的比率接近3:1,說明rap是由單基因隱性突變所致。通過混池基因組重測序數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)gene31672第二個外顯子上存在一個C到T的SNP,能夠引起翻譯提前終止,表明該基因是RAP候選基因。對F2群體中50個突變單株測序發(fā)現(xiàn)該SNP均純合,進一步證明gene31672與表型連鎖。此外,我們發(fā)現(xiàn)rap葉柄中RAP表達量顯著下降,說明RAP轉(zhuǎn)錄本由于無意介導的衰變而降解。2.在森林草莓中,RAP有7個同源基因,同屬于GST家族中的phi亞家族。這8個GST基因具有不同的表達模式。RAP在Ruegen果實中表達量最高,且隨著果實成熟顯著上調(diào)。對RAPpro::GUS轉(zhuǎn)基因株系GUS活性分析表明RAP在葉柄表皮和維管束組織特異表達。在擬南芥突變體tt19-7中過表達RAP時,下胚軸、莖稈和葉片重新積累花青素,表明RAP是擬南芥中TT19的直系同源基因。3.將Ruegen與rap雜交,在66棵綠色葉柄的F2代植株中分離出一棵帶有MYB10的純和突變體材料(MYB10+;rap-),說明MYB10與RAP連鎖。與野生型Ruegen相比,該交換單株果皮幾乎不積累花青素,瘦果顏色也顯著變淺,表明RAP是調(diào)控果實顏色的關(guān)鍵基因且位于MYB10下游。q RT-PCR檢測表明RAP與MYB10有共表達趨勢。HPLC分析表明MYB10+;rap-中各花青素成分顯著低于MYB10+;RAP+,說明RAP轉(zhuǎn)運花青素具有廣譜性。4.瞬時轉(zhuǎn)化實驗表明,同時過表達RAP和MYB10能使rap果實重新積累花青素,而其它同源基因過表達卻不能達到相同效果。煙草瞬時轉(zhuǎn)化實驗表明RAP、RAP-L1和RAP-L3-5定位于細胞質(zhì)和細胞核,部分定位于液泡膜,而RAP-L2定位在葉綠體上。這些結(jié)果說明,除了表達水平調(diào)控,蛋白序列和亞細胞定位變化也是RAP同源基因功能分化的因素。此外,蛋白結(jié)構(gòu)域置換實驗表明RAP的N端與C端共同決定了花青素轉(zhuǎn)運活性。5.在rap背景下穩(wěn)定過表達RAP時,葉柄重新變紅;根尖和雌蕊柱頭等本來不積累花青素的部位也變紅;果實變紅,但不同于野生型且不依賴MYB10。用RNA干擾瞬時下調(diào)栽培草莓果實中RAP的表達水平,花青素含量顯著下降。這些結(jié)果說明,RAP可作為草莓果實顏色育種的候選基因。
【學位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S668.4
【部分圖文】：

花青素的基本結(jié)構(gòu)母核Fig1-1Basicchemicalstructureofanthocyanins

森林草莓花青素下降突變體 RAP 基因的克隆與功能解析也很大，其中花青素含量豐富的果實有草莓、藍莓、越桔等。研究證明，花青種類和含量由植物基因型與外界生長環(huán)境共同決定。 花青素的合成代謝分子機制.1 花青素合成途徑中結(jié)構(gòu)基因研究進展花青素在細胞質(zhì)中合成，最終被運送到液泡中儲存�；ㄇ嗨氐暮铣蛇^程比較復有多種代謝產(chǎn)物的參與，其合成的前體物質(zhì)是苯丙氨酸。近年來，有關(guān)花青素的分子機制的研究已相對深入，影響花青素合成代謝的基因主要分為結(jié)構(gòu)基因控基因兩類。其中結(jié)構(gòu)基因在花青素合成途徑中編碼了一系列生物合成酶，這成酶在各個生物中功能相對保守，如圖 1-2所示。

森林草莓花青素下降突變體 RAP 基因的克隆與功能解析和 EGL3 等，WD40 蛋白包括 TTG1 等(P Li et al 2016)。其中，bHLH 與 R2R3-MYB的特定區(qū)域結(jié)合來識別 DNA 序列，WD40 可以與 bHLH 直接互作從而增強復合體的穩(wěn)定性，R2R3-MYBs、bHLH、WD40 三者結(jié)合形成蛋白復合體(MBW)，共同調(diào)控相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的表達，從而促進花青素的合成，如圖 1-3 A 所示。其他轉(zhuǎn)錄因子主要通過與 R2R3-MYB競爭 bHLH蛋白來調(diào)節(jié)花青素的生物合成，如圖 1-3 B所示(Zhang et al 2013)。例如，在擬南芥中，MYBL2 和 JAZ 家族蛋白能與 bHLH互作從而抑制 MBW 的活性(Xie et al 2016)。此外，存在一部分轉(zhuǎn)錄因子通過通過與 MBW結(jié)合來負控制花青素的合成。例如，‘澳洲青蘋’中分離出了 MdHB1 是一種 HD-Zip蛋白，MdHB1可將MdMYB、MdbHLH、MdTTG1或MBW復合體束縛在細胞質(zhì)內(nèi)，從而降低了 MdDFR、MdUFGT 的轉(zhuǎn)錄水平，抑制花青素的合成（姜永華 2017）。
【參考文獻】

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本文編號：2853656