聚酮化合物種類(lèi)繁多,通常具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗腫瘤、免疫抑制等多種生物活性,因而引起人們的廣泛關(guān)注。聚酮化合物的碳鏈骨架由聚酮合酶催化。不同類(lèi)型聚酮化合物生物合成途徑的揭示,將為未來(lái)發(fā)現(xiàn)乃至創(chuàng)造新型聚酮化合物的研究指明方向。本研究以?xún)蓚�(gè)聚酮合酶基因簇為研究對(duì)象,利用遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)的研究方法,對(duì)基因簇的功能及調(diào)控進(jìn)行了探索。1鏈霉菌SH-62基因組中聚酮合酶基因簇cluster 9的研究來(lái)自鏈霉菌SH-62的聚酮合酶基因簇cluster 9屬于I型PKS,與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的天然產(chǎn)物合成基因簇同源性較低,可能是一個(gè)新的天然產(chǎn)物生物合成基因簇。包含有聚酮合酶基因簇cluster 9的BAC質(zhì)粒在Streptomyces albus中異源表達(dá)產(chǎn)生3個(gè)疑似的代謝產(chǎn)物。為了檢測(cè)這3個(gè)化合物與cluster 9的相關(guān)性,采用兩種基因組編輯方法,包括λ-Red介導(dǎo)的PCR-targeting系統(tǒng)和CRISPR/Cas9-CodA(sm)系統(tǒng),對(duì)cluster 9中的核心pks基因進(jìn)行了敲除。發(fā)現(xiàn)核心基因的敲除沒(méi)有影響3個(gè)化合物的合成,說(shuō)明它們并不是cluster 9的異源表達(dá)產(chǎn)物。2 Aureothin生物合成基因簇中調(diào)控因子AurD的研究Aureothin是具有良好生物活性的硝基芳香類(lèi)抗生素,在其生物合成基因簇中只發(fā)現(xiàn)了一個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子aurD。敲除aurD基因會(huì)阻斷aureothin的合成過(guò)程,而aurD基因的回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)一直無(wú)法成功�？紤]到aurD基因的過(guò)量表達(dá)可能會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng),因此本研究采用了基因原位回補(bǔ)的方法,將安裝有組成型強(qiáng)啟動(dòng)子PermE*的aurD基因重新插入到原基因的敲除位點(diǎn),成功獲得了基因回補(bǔ)突變菌株�；匮a(bǔ)菌株的發(fā)酵產(chǎn)物分析證實(shí)aurD基因的回補(bǔ)能夠恢復(fù)aureothin的產(chǎn)生,并且因?yàn)榻M成型強(qiáng)啟動(dòng)子增強(qiáng)了aurD基因的表達(dá)使得aureothin產(chǎn)量顯著提升,進(jìn)一步地證實(shí)了aurD對(duì)aureothin生物合成的正調(diào)控效應(yīng)。AurD具有一個(gè)OmpR類(lèi)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個(gè)細(xì)菌轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域,屬于SARP家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白。為了研究AurD蛋白的調(diào)控機(jī)制,分別在大腸桿菌和鏈霉菌中超量表達(dá)AurD蛋白,在鏈霉菌中,AurD蛋白的表達(dá)量很低;在大腸桿菌中,AurD蛋白主要以包涵體形式存在。未來(lái)需要在表達(dá)系統(tǒng)和條件上進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：Q78
【部分圖文】：

安莎類(lèi)的利福霉素；蒽環(huán)類(lèi)的柔紅霉素、阿霉素等，這些化合物具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗腫瘤、免疫抑制等多種生物活性，因而引起人們的廣泛關(guān)注[19]。聚酮類(lèi)化合物的生物合成與脂肪酸的生物合成類(lèi)似[20]，有相似的前體（如乙酰-CoA、丙二酰-CoA）和碳鏈延伸機(jī)制（克萊森縮合反應(yīng)）。聚酮合酶是一類(lèi)包含有多個(gè)結(jié)構(gòu)域的多功能酶，其中酮基合成酶（KS）、�；D(zhuǎn)移酶（AT）和�；d體蛋白（ACP）是聚酮鏈延伸的必需結(jié)構(gòu)域。KS 通過(guò)硫醇�；D(zhuǎn)移反應(yīng)接收來(lái)自上游延伸的聚酮鏈，然后催化與ACP結(jié)合的�；由靻卧ㄈ绫�-CoA、甲基丙二酰-CoA）的脫羧反應(yīng)形成一個(gè)含有碳負(fù)離子的中間體，該中間體對(duì)延伸的�；溸M(jìn)行親核攻擊，形成 C-C 鍵，從而使鏈延長(zhǎng)。AT 嚴(yán)格地篩選底物，并通過(guò)硫酯交換反應(yīng)將�；D(zhuǎn)移給 ACP，形成�；�-S-ACP。ACP 能夠與延伸單元或聚酮中間產(chǎn)物通過(guò)硫酯鍵共價(jià)形成磷酸泛酰巰基乙胺臂，將中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到下一個(gè)模塊[21, 22]。除此之外，β-酮基可能進(jìn)一步被多酶復(fù)合體中的酮基還原酶（KR）、脫水酶（DH）、烯基還原酶（ER）加工處理，形成結(jié)構(gòu)多樣的聚酮骨架。

聚酮合酶基因簇 cluster 9 和 Aureothin 生物合成基因簇中調(diào)控因子 AurD 的研究的一個(gè)脫羧聚合過(guò)程。II 型 PKSs 是一類(lèi)游離的多酶復(fù)合體，復(fù)合體中的各個(gè)結(jié)構(gòu)域反式作用，且每一個(gè)蛋白都有獨(dú)立的催化功能并且在聚酮化合物合成過(guò)程中可以重復(fù)使用[23]。與 I 型 PKSs 和 II 型 PKSs 相比，III 型 PKSs 結(jié)構(gòu)更加簡(jiǎn)單，通常以蛋白二聚體的形式存在并且不需要 ACP 延伸肽鏈。它可以在一個(gè)活性位點(diǎn)完成一系列的脫羧聚合反應(yīng)和環(huán)化反應(yīng)[24, 25]。

圖 1.3 I 型 PKSs（脫氧紅霉內(nèi)酯合成酶）生物合成機(jī)制[26]Figure 1.3 The biosynthetic mechanism of type I polyketide（deoxyerythronolide-B-synthase）[26]2.1.2 迭代的 I 型 PKSs雖然來(lái)源于細(xì)菌的 I型 PKSs 大都是非迭代的，仍有一部分源于細(xì)菌的 I 型 PKSs有別于源于真菌的迭代的 I 型 PKSs 和源于細(xì)菌的非迭代 I 型 PKSs。它們一般具有基本的模塊組成，但其排布方式不同，可分為完全迭代的 PKS（s類(lèi)似于真菌的迭代）和部分迭代的 PKSs（模塊的迭代）[27, 28]。完全迭代的 PKSs 即是整個(gè) PKS 復(fù)合物的重復(fù)，能夠合成如芳香族化合物 avilamycin[29]、多元不飽和脂肪酸（PUFA）EPA和 DHA[30, 31]、烯二炔類(lèi)化合物 C-1027[32]、PTM 類(lèi)化合物 HSAF[33, 34]。部分迭代的PKSs 則是多模塊組裝線(xiàn)中一個(gè)或兩個(gè)模塊的重復(fù)，通常表現(xiàn)為 PKSs 中的模塊數(shù)少于聚酮鏈延伸過(guò)程中的縮合反應(yīng)次數(shù)，這一現(xiàn)象也被形象的稱(chēng)為 打滑[35, 36]。近些年來(lái)報(bào)道出很多部分迭代的 PKSs。
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 谷燕燕;耿偉濤;宋存江;;鏈霉菌無(wú)痕敲除方法研究進(jìn)展[J];生物工程學(xué)報(bào);2013年08期

2 陳敏捷;王廣華;戴世鯤;謝練武;李翔;;鏈霉菌聚酮類(lèi)次生代謝產(chǎn)物及其生物合成基因簇[J];微生物學(xué)報(bào);2009年12期

3 楊震;;活性天然產(chǎn)物和結(jié)構(gòu)多樣性類(lèi)天然產(chǎn)物的合成[J];化學(xué)進(jìn)展;2009年01期

4 白林泉;鄧子新;;微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇與藥物創(chuàng)新[J];中國(guó)抗生素雜志;2006年02期

本文編號(hào)：2844956