聚酮化合物種類繁多,通常具有抗細菌、抗真菌、抗腫瘤、免疫抑制等多種生物活性,因而引起人們的廣泛關注。聚酮化合物的碳鏈骨架由聚酮合酶催化。不同類型聚酮化合物生物合成途徑的揭示,將為未來發(fā)現乃至創(chuàng)造新型聚酮化合物的研究指明方向。本研究以兩個聚酮合酶基因簇為研究對象,利用遺傳學、分子生物學、生物化學的研究方法,對基因簇的功能及調控進行了探索。1鏈霉菌SH-62基因組中聚酮合酶基因簇cluster 9的研究來自鏈霉菌SH-62的聚酮合酶基因簇cluster 9屬于I型PKS,與數據庫中已知的天然產物合成基因簇同源性較低,可能是一個新的天然產物生物合成基因簇。包含有聚酮合酶基因簇cluster 9的BAC質粒在Streptomyces albus中異源表達產生3個疑似的代謝產物。為了檢測這3個化合物與cluster 9的相關性,采用兩種基因組編輯方法,包括λ-Red介導的PCR-targeting系統和CRISPR/Cas9-CodA(sm)系統,對cluster 9中的核心pks基因進行了敲除。發(fā)現核心基因的敲除沒有影響3個化合物的合成,說明它們并不是cluster 9的異源表達產物。2 Aureothin生物合成基因簇中調控因子AurD的研究Aureothin是具有良好生物活性的硝基芳香類抗生素,在其生物合成基因簇中只發(fā)現了一個潛在的轉錄調控因子aurD。敲除aurD基因會阻斷aureothin的合成過程,而aurD基因的回補實驗一直無法成功�？紤]到aurD基因的過量表達可能會影響細胞的生長,因此本研究采用了基因原位回補的方法,將安裝有組成型強啟動子PermE*的aurD基因重新插入到原基因的敲除位點,成功獲得了基因回補突變菌株。回補菌株的發(fā)酵產物分析證實aurD基因的回補能夠恢復aureothin的產生,并且因為組成型強啟動子增強了aurD基因的表達使得aureothin產量顯著提升,進一步地證實了aurD對aureothin生物合成的正調控效應。AurD具有一個OmpR類DNA結合結構域和一個細菌轉錄激活結構域,屬于SARP家族轉錄調控蛋白。為了研究AurD蛋白的調控機制,分別在大腸桿菌和鏈霉菌中超量表達AurD蛋白,在鏈霉菌中,AurD蛋白的表達量很低;在大腸桿菌中,AurD蛋白主要以包涵體形式存在。未來需要在表達系統和條件上進行進一步的優(yōu)化。
【學位單位】：華中農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：Q78
【部分圖文】：

安莎類的利福霉素；蒽環(huán)類的柔紅霉素、阿霉素等，這些化合物具有抗細菌、抗真菌、抗腫瘤、免疫抑制等多種生物活性，因而引起人們的廣泛關注[19]。聚酮類化合物的生物合成與脂肪酸的生物合成類似[20]，有相似的前體（如乙酰-CoA、丙二酰-CoA）和碳鏈延伸機制（克萊森縮合反應）。聚酮合酶是一類包含有多個結構域的多功能酶，其中酮基合成酶（KS）、�；D移酶（AT）和酰基載體蛋白（ACP）是聚酮鏈延伸的必需結構域。KS 通過硫醇�；D移反應接收來自上游延伸的聚酮鏈，然后催化與ACP結合的酰基延伸單元（如丙二酰-CoA、甲基丙二酰-CoA）的脫羧反應形成一個含有碳負離子的中間體，該中間體對延伸的�；溸M行親核攻擊，形成 C-C 鍵，從而使鏈延長。AT 嚴格地篩選底物，并通過硫酯交換反應將酰基轉移給 ACP，形成�；�-S-ACP。ACP 能夠與延伸單元或聚酮中間產物通過硫酯鍵共價形成磷酸泛酰巰基乙胺臂，將中間產物轉移到下一個模塊[21, 22]。除此之外，β-酮基可能進一步被多酶復合體中的酮基還原酶（KR）、脫水酶（DH）、烯基還原酶（ER）加工處理，形成結構多樣的聚酮骨架。

聚酮合酶基因簇 cluster 9 和 Aureothin 生物合成基因簇中調控因子 AurD 的研究的一個脫羧聚合過程。II 型 PKSs 是一類游離的多酶復合體，復合體中的各個結構域反式作用，且每一個蛋白都有獨立的催化功能并且在聚酮化合物合成過程中可以重復使用[23]。與 I 型 PKSs 和 II 型 PKSs 相比，III 型 PKSs 結構更加簡單，通常以蛋白二聚體的形式存在并且不需要 ACP 延伸肽鏈。它可以在一個活性位點完成一系列的脫羧聚合反應和環(huán)化反應[24, 25]。

圖 1.3 I 型 PKSs（脫氧紅霉內酯合成酶）生物合成機制[26]Figure 1.3 The biosynthetic mechanism of type I polyketide（deoxyerythronolide-B-synthase）[26]2.1.2 迭代的 I 型 PKSs雖然來源于細菌的 I型 PKSs 大都是非迭代的，仍有一部分源于細菌的 I 型 PKSs有別于源于真菌的迭代的 I 型 PKSs 和源于細菌的非迭代 I 型 PKSs。它們一般具有基本的模塊組成，但其排布方式不同，可分為完全迭代的 PKS（s類似于真菌的迭代）和部分迭代的 PKSs（模塊的迭代）[27, 28]。完全迭代的 PKSs 即是整個 PKS 復合物的重復，能夠合成如芳香族化合物 avilamycin[29]、多元不飽和脂肪酸（PUFA）EPA和 DHA[30, 31]、烯二炔類化合物 C-1027[32]、PTM 類化合物 HSAF[33, 34]。部分迭代的PKSs 則是多模塊組裝線中一個或兩個模塊的重復，通常表現為 PKSs 中的模塊數少于聚酮鏈延伸過程中的縮合反應次數，這一現象也被形象的稱為 打滑[35, 36]。近些年來報道出很多部分迭代的 PKSs。
【參考文獻】

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1 谷燕燕;耿偉濤;宋存江;;鏈霉菌無痕敲除方法研究進展[J];生物工程學報;2013年08期

2 陳敏捷;王廣華;戴世鯤;謝練武;李翔;;鏈霉菌聚酮類次生代謝產物及其生物合成基因簇[J];微生物學報;2009年12期

3 楊震;;活性天然產物和結構多樣性類天然產物的合成[J];化學進展;2009年01期

4 白林泉;鄧子新;;微生物次級代謝產物生物合成基因簇與藥物創(chuàng)新[J];中國抗生素雜志;2006年02期

本文編號：2844956