轉(zhuǎn)錄因子Pax5(也稱為B細(xì)胞特異激活蛋白),Pax家族成員,在B細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中,自淋巴祖細(xì)胞階段至成熟B細(xì)胞階段均表達(dá),其編碼的B細(xì)胞特異激活蛋白是定位于B細(xì)胞核的反式作用元件,對(duì)B細(xì)胞的成熟分化具有重要的作用。本研究以我國(guó)常見(jiàn)的淡水魚種——鯉魚為材料,提取頭腎總RNA,反轉(zhuǎn)cDNA作為模板,經(jīng)PCR擴(kuò)增得到1263bp的Pax5 X1和1191bp的Pax5 X5兩種剪切體的ORF全長(zhǎng),并對(duì)其進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型和功能預(yù)測(cè)和進(jìn)化分析。實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了嗜水氣單胞菌免疫刺激鯉魚模型,通過(guò)浸泡和注射兩種方式,在刺激后的不同時(shí)間點(diǎn)取材免疫及粘膜相關(guān)組織,通過(guò)定量PCR檢測(cè)了Pax5基因的表達(dá)變化。結(jié)果表明,Pax5在頭腎、脾臟、肝臟、前腸、中腸和后腸中均有表達(dá)。注射刺激中頭腎表達(dá)最高,腸組織各段中前腸表達(dá)量最高。經(jīng)注射免疫刺激后,在頭腎和脾臟中出現(xiàn)顯著的表達(dá)下調(diào)。浸泡刺激中頭腎、脾臟表達(dá)較高,腸組織各段中后腸表達(dá)量最高。經(jīng)浸泡免疫刺激后,頭腎、脾臟表現(xiàn)出顯著的表達(dá)下調(diào)。實(shí)驗(yàn)還檢測(cè)了鯉魚早期發(fā)育階段自受精后第1天起至孵化第29天共9個(gè)發(fā)育時(shí)期魚體中Pax5的表達(dá),從定量PCR的檢測(cè)結(jié)果中可以看出,在鯉魚發(fā)育階段,Pax5基因在受精后1-2天存在母源性表達(dá),在孵化后降低。到孵化后14天,Pax5的表達(dá)量持續(xù)增大,至孵化后29天表達(dá)量最大。由于Pax5自淋巴祖細(xì)胞階段一直到成熟B細(xì)胞階段進(jìn)行表達(dá),直到漿細(xì)胞停止進(jìn)行表達(dá),因此,發(fā)育期檢測(cè)結(jié)果提示,受精前期以及孵化后初期應(yīng)對(duì)外界環(huán)境可能存在母源性漿細(xì)胞,孵化后期Pax5表達(dá)上調(diào),與抗體IgM的表達(dá)模式相似,這是鯉魚自身B細(xì)胞分化成熟的階段,這一時(shí)期Pax5的表達(dá)上調(diào)可能參與了自身B細(xì)胞分化成熟的過(guò)程。為了進(jìn)一步驗(yàn)證,實(shí)驗(yàn)利用構(gòu)建的Pax5的原核表達(dá)體系,誘導(dǎo)表達(dá)Pax5蛋白,并制備Pax5多克隆抗體,從蛋白水平對(duì)上述不同發(fā)育時(shí)期的鯉魚組織總蛋白中Pax5的表達(dá)進(jìn)行了western-blot檢測(cè),從結(jié)果中可以看出,與mRNA水平的定量PCR檢測(cè)結(jié)果較為一致,在鯉魚早期發(fā)育階段的個(gè)體中,至孵化后29天達(dá)到在該檢測(cè)時(shí)間范圍內(nèi)的蛋白表達(dá)量的最大值,但是與成魚血清中Pax5的表達(dá)量相比,仍然表達(dá)量略低。并用IgM多克隆抗體,從蛋白水平對(duì)上述不同發(fā)育時(shí)期的鯉魚組織總蛋白中IgM的表達(dá)進(jìn)行了western-blot檢測(cè),從結(jié)果中可以看出,與mRNA水平的定量PCR檢測(cè)結(jié)果較為一致,在鯉魚早期發(fā)育階段的個(gè)體中,至孵化后29天達(dá)到在該檢測(cè)時(shí)間范圍內(nèi)的蛋白表達(dá)量的最大值,高于成魚血清中Pax5的表達(dá)量,提示Pax5可能在IgM抗體生成細(xì)胞的分化中發(fā)揮作用。特異性免疫最早產(chǎn)生于低等脊椎動(dòng)物魚類,因此,對(duì)魚類特異性免疫相關(guān)分子及免疫細(xì)胞的研究將有助于深入的了解特異性免疫的起源和進(jìn)化,而轉(zhuǎn)錄因子既可以作為區(qū)分不同發(fā)育階段B淋巴細(xì)胞類群的輔助方法,同時(shí)也是認(rèn)識(shí)B細(xì)胞的分化成熟機(jī)制的重要依據(jù),正因?yàn)槿绱?對(duì)鯉魚Pax5基因的克隆及其功能的初步研究對(duì)于魚類B細(xì)胞成熟及其介導(dǎo)的特異性免疫機(jī)制的深入探討具有非常重要的意義。本研究通過(guò)克隆鯉魚Pax5基因,原核表達(dá)其蛋白并制備抗體為進(jìn)一步在分子和細(xì)胞水平對(duì)Pax5的功能研究奠定了基礎(chǔ),同時(shí)對(duì)免疫刺激條件下及不同發(fā)育時(shí)期Pax5在組織及個(gè)體水平的表達(dá)變化及其機(jī)制的研究提供了參考和選擇。
【學(xué)位單位】：山東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S917.4
【部分圖文】：

圖 1-1 早期淋巴生成過(guò)程中譜系的基因調(diào)控（引自 Michael SchebesFig 1-1 Genetic control of lineage commitment in early lymphopoiesis(Cited from M1.3 通過(guò) E2A 和 EBF 控制免疫球蛋白基因的重組B 淋巴細(xì)胞生成全部的不同的抗體，用于體液防御大量的抗原。全部的胞發(fā)育中分別通過(guò)對(duì) IgH 和 IgL 基因的連續(xù)重新安排 (免疫球蛋白輕鏈)免疫球蛋白基因的重組取決于四個(gè)特定淋巴蛋白質(zhì)的活性。V(D)J 重組RAG2 蛋白質(zhì)組成，識(shí)別出重組信號(hào)序列，在信號(hào)編碼邊界高度特異阻斷E2A 和 EBF 控制 VDJ 重排，至少通過(guò) RAG1 和 RAG2 的部分表達(dá)調(diào)控。E2A 和 EBF 在 V(D)J 重組中更直接的作用最近在非淋巴細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中明。在人類胚胎腎臟細(xì)胞系的異位表達(dá)，E2A 或 EBF 蛋白能和 RAG1 和

山東師范大學(xué)碩士學(xué)位論文的激活，反過(guò)來(lái)又可以抑制 XBP1。然而，僅 Pax5 的喪失確實(shí)不會(huì)阻止在成熟的 Pax5 陷型 B 細(xì)胞中 XBP1 表達(dá)，表明其他轉(zhuǎn)錄因子在終末分化期間參與激活 XBP1。很有可是與轉(zhuǎn)錄因子 ATF6 結(jié)合激活 XBP1 啟動(dòng)子以響應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）應(yīng)激[26]。大幅增加早漿細(xì)胞中的抗體合成導(dǎo)致非折疊蛋白質(zhì)在 ER 中的積累，因此激活非折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)，增加了在 ER 中蛋白質(zhì)折疊系統(tǒng)能力。ATF6 組成型在 ER 表達(dá)為跨膜蛋白，僅在 ER 應(yīng)時(shí)才從膜上裂開(kāi)再移植到細(xì)胞核后，誘導(dǎo)非折疊蛋白反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄程序，包括 XBP1 基因激活。此外，XBP1 表達(dá)也通過(guò) ER 壓力受轉(zhuǎn)錄后水平控制。應(yīng)激激活的內(nèi)切核糖核酸最近顯示 IRE1 切割XBP1 mRNA 和從而從編碼區(qū)域拼接小的內(nèi)含子導(dǎo)致產(chǎn)生一種新型XBP1 同種型增加漿細(xì)胞轉(zhuǎn)錄活性[27]。

.4.3 檢測(cè)60min 滅菌的槍頭挑單個(gè)菌于 Ep 管中，輕輕吹打，37管底部有沉淀，吹吸混勻，取 1μl 模板做菌落 PCR。對(duì)應(yīng)條帶較亮的幾個(gè)分別加入到含氨芐液體培養(yǎng)基錐保存。培養(yǎng)基渾濁后，取菌樣測(cè)序。結(jié)果魚 Pax5 開(kāi)放閱讀框擴(kuò)增預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)鯉魚 Pax5 在頭腎中的表達(dá)最高，故選增結(jié)果，鯉魚 Pax5 X1 的 ORF(1263bp）和 Pax5 X5 的
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 程建華;范淑榮;;胎兒早期發(fā)育階段的突觸超微結(jié)構(gòu)[J];江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1988年03期

2 朱瓊;趙金良;萇建菊;Jeerawat THAMMARATSUNTORN;錢葉洲;吳超;錢德;;鱖早期發(fā)育階段骨骼肌纖維的增生與肥大生長(zhǎng)[J];動(dòng)物學(xué)雜志;2011年06期

3 吳光宗,楊東萊,龐鴻艷;鱸魚早期發(fā)育階段的形態(tài)特征[J];海洋科學(xué);1984年03期

4 ;科技點(diǎn)滴[J];世界農(nóng)業(yè);2007年10期

5 區(qū)又君;李加兒;柳琪;周慧;;斜帶髭鯛和紫紅笛鯛早期發(fā)育階段的行為選擇[J];水生態(tài)學(xué)雜志;2017年01期

6 李達(dá);劉長(zhǎng)琳;李昂;杜騰飛;柳淑芳;莊志猛;;金烏賊(Sepia esculenta)早期發(fā)育階段內(nèi)殼形態(tài)學(xué)指標(biāo)的主成分分析[J];漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展;2017年05期

7 劉長(zhǎng)琳;劉思瑋;趙法箴;陳四清;劉春勝;燕敬平;;金烏賊(Sepia esculenta)早期發(fā)育階段相關(guān)酶活性的變化[J];漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展;2016年06期

8 于濤;李耕;劉鵬;董樹亭;張吉旺;趙斌;柏晗;;玉米早期發(fā)育階段粒位效應(yīng)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析[J];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué);2016年01期

9 彭聰;樊啟學(xué);劉汝鵬;胡培培;姚昌林;王昆鵬;;泥鰍早期發(fā)育階段的食性研究[J];水生態(tài)學(xué)雜志;2013年01期

10 何滔;肖志忠;劉清華;李軍;;條石鯛早期發(fā)育階段的生長(zhǎng)模式[J];水產(chǎn)學(xué)報(bào);2012年08期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 王彥海;臺(tái)灣海峽魚類絳蟲種類、季節(jié)動(dòng)態(tài)及兩種假葉目絳蟲生活史早期發(fā)育階段的觀察[D];廈門大學(xué);2001年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 房蔚;鯉魚轉(zhuǎn)錄因子Pax5基因克隆及其功能的初步研究[D];山東師范大學(xué);2018年

2 彭聰;泥鰍早期發(fā)育階段攝食生態(tài)學(xué)的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

3 李煙亮;鱤早期發(fā)育階段攝食相關(guān)生理及生態(tài)研究[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

4 劉銀華;云紋石斑魚早期發(fā)育階段的生物學(xué)及育苗技術(shù)研究[D];集美大學(xué);2014年

5 李姝熳;久效磷對(duì)早期發(fā)育階段馬糞海膽（Hemicentrotus pulcherrimus）膽堿能系統(tǒng)的影響[D];中國(guó)海洋大學(xué);2010年

6 曹延超;淇河鯽穿孔素基因的克隆與表達(dá)研究[D];河南師范大學(xué);2014年

7 盧艷艷;半滑舌鰨早期發(fā)育階段的生物學(xué)研究[D];集美大學(xué);2011年

8 祝東梅;草魚早期發(fā)育階段細(xì)菌群落的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

9 馬繼銘;菲與烷基菲對(duì)海水青鳉早期發(fā)育階段的毒性效應(yīng)比較研究[D];大連海事大學(xué);2012年

10 秦志清;漠斑牙鲆早期發(fā)育階段的生物學(xué)研究[D];集美大學(xué);2008年

本文編號(hào)：2845392