轉(zhuǎn)錄因子Pax5(也稱為B細胞特異激活蛋白),Pax家族成員,在B細胞發(fā)育過程中,自淋巴祖細胞階段至成熟B細胞階段均表達,其編碼的B細胞特異激活蛋白是定位于B細胞核的反式作用元件,對B細胞的成熟分化具有重要的作用。本研究以我國常見的淡水魚種——鯉魚為材料,提取頭腎總RNA,反轉(zhuǎn)cDNA作為模板,經(jīng)PCR擴增得到1263bp的Pax5 X1和1191bp的Pax5 X5兩種剪切體的ORF全長,并對其進行保守結(jié)構(gòu)域預測、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型和功能預測和進化分析。實驗構(gòu)建了嗜水氣單胞菌免疫刺激鯉魚模型,通過浸泡和注射兩種方式,在刺激后的不同時間點取材免疫及粘膜相關組織,通過定量PCR檢測了Pax5基因的表達變化。結(jié)果表明,Pax5在頭腎、脾臟、肝臟、前腸、中腸和后腸中均有表達。注射刺激中頭腎表達最高,腸組織各段中前腸表達量最高。經(jīng)注射免疫刺激后,在頭腎和脾臟中出現(xiàn)顯著的表達下調(diào)。浸泡刺激中頭腎、脾臟表達較高,腸組織各段中后腸表達量最高。經(jīng)浸泡免疫刺激后,頭腎、脾臟表現(xiàn)出顯著的表達下調(diào)。實驗還檢測了鯉魚早期發(fā)育階段自受精后第1天起至孵化第29天共9個發(fā)育時期魚體中Pax5的表達,從定量PCR的檢測結(jié)果中可以看出,在鯉魚發(fā)育階段,Pax5基因在受精后1-2天存在母源性表達,在孵化后降低。到孵化后14天,Pax5的表達量持續(xù)增大,至孵化后29天表達量最大。由于Pax5自淋巴祖細胞階段一直到成熟B細胞階段進行表達,直到漿細胞停止進行表達,因此,發(fā)育期檢測結(jié)果提示,受精前期以及孵化后初期應對外界環(huán)境可能存在母源性漿細胞,孵化后期Pax5表達上調(diào),與抗體IgM的表達模式相似,這是鯉魚自身B細胞分化成熟的階段,這一時期Pax5的表達上調(diào)可能參與了自身B細胞分化成熟的過程。為了進一步驗證,實驗利用構(gòu)建的Pax5的原核表達體系,誘導表達Pax5蛋白,并制備Pax5多克隆抗體,從蛋白水平對上述不同發(fā)育時期的鯉魚組織總蛋白中Pax5的表達進行了western-blot檢測,從結(jié)果中可以看出,與mRNA水平的定量PCR檢測結(jié)果較為一致,在鯉魚早期發(fā)育階段的個體中,至孵化后29天達到在該檢測時間范圍內(nèi)的蛋白表達量的最大值,但是與成魚血清中Pax5的表達量相比,仍然表達量略低。并用IgM多克隆抗體,從蛋白水平對上述不同發(fā)育時期的鯉魚組織總蛋白中IgM的表達進行了western-blot檢測,從結(jié)果中可以看出,與mRNA水平的定量PCR檢測結(jié)果較為一致,在鯉魚早期發(fā)育階段的個體中,至孵化后29天達到在該檢測時間范圍內(nèi)的蛋白表達量的最大值,高于成魚血清中Pax5的表達量,提示Pax5可能在IgM抗體生成細胞的分化中發(fā)揮作用。特異性免疫最早產(chǎn)生于低等脊椎動物魚類,因此,對魚類特異性免疫相關分子及免疫細胞的研究將有助于深入的了解特異性免疫的起源和進化,而轉(zhuǎn)錄因子既可以作為區(qū)分不同發(fā)育階段B淋巴細胞類群的輔助方法,同時也是認識B細胞的分化成熟機制的重要依據(jù),正因為如此,對鯉魚Pax5基因的克隆及其功能的初步研究對于魚類B細胞成熟及其介導的特異性免疫機制的深入探討具有非常重要的意義。本研究通過克隆鯉魚Pax5基因,原核表達其蛋白并制備抗體為進一步在分子和細胞水平對Pax5的功能研究奠定了基礎,同時對免疫刺激條件下及不同發(fā)育時期Pax5在組織及個體水平的表達變化及其機制的研究提供了參考和選擇。
【學位單位】：山東師范大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S917.4
【部分圖文】：

圖 1-1 早期淋巴生成過程中譜系的基因調(diào)控（引自 Michael SchebesFig 1-1 Genetic control of lineage commitment in early lymphopoiesis(Cited from M1.3 通過 E2A 和 EBF 控制免疫球蛋白基因的重組B 淋巴細胞生成全部的不同的抗體，用于體液防御大量的抗原。全部的胞發(fā)育中分別通過對 IgH 和 IgL 基因的連續(xù)重新安排 (免疫球蛋白輕鏈)免疫球蛋白基因的重組取決于四個特定淋巴蛋白質(zhì)的活性。V(D)J 重組RAG2 蛋白質(zhì)組成，識別出重組信號序列，在信號編碼邊界高度特異阻斷E2A 和 EBF 控制 VDJ 重排，至少通過 RAG1 和 RAG2 的部分表達調(diào)控。E2A 和 EBF 在 V(D)J 重組中更直接的作用最近在非淋巴細胞的實驗中明。在人類胚胎腎臟細胞系的異位表達，E2A 或 EBF 蛋白能和 RAG1 和

山東師范大學碩士學位論文的激活，反過來又可以抑制 XBP1。然而，僅 Pax5 的喪失確實不會阻止在成熟的 Pax5 陷型 B 細胞中 XBP1 表達，表明其他轉(zhuǎn)錄因子在終末分化期間參與激活 XBP1。很有可是與轉(zhuǎn)錄因子 ATF6 結(jié)合激活 XBP1 啟動子以響應內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）應激[26]。大幅增加早漿細胞中的抗體合成導致非折疊蛋白質(zhì)在 ER 中的積累，因此激活非折疊蛋白質(zhì)反應，增加了在 ER 中蛋白質(zhì)折疊系統(tǒng)能力。ATF6 組成型在 ER 表達為跨膜蛋白，僅在 ER 應時才從膜上裂開再移植到細胞核后，誘導非折疊蛋白反應的轉(zhuǎn)錄程序，包括 XBP1 基因激活。此外，XBP1 表達也通過 ER 壓力受轉(zhuǎn)錄后水平控制。應激激活的內(nèi)切核糖核酸最近顯示 IRE1 切割XBP1 mRNA 和從而從編碼區(qū)域拼接小的內(nèi)含子導致產(chǎn)生一種新型XBP1 同種型增加漿細胞轉(zhuǎn)錄活性[27]。

.4.3 檢測60min 滅菌的槍頭挑單個菌于 Ep 管中，輕輕吹打，37管底部有沉淀，吹吸混勻，取 1μl 模板做菌落 PCR。對應條帶較亮的幾個分別加入到含氨芐液體培養(yǎng)基錐保存。培養(yǎng)基渾濁后，取菌樣測序。結(jié)果魚 Pax5 開放閱讀框擴增預實驗中發(fā)現(xiàn)鯉魚 Pax5 在頭腎中的表達最高，故選增結(jié)果，鯉魚 Pax5 X1 的 ORF(1263bp）和 Pax5 X5 的
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本文編號：2845392