目的構建整合素α5(integrinα5,ITGA5)基因sh RNA慢病毒載體及ITGA5基因穩(wěn)定沉默的肝癌Bel-7404細胞系,檢測ITGA5基因對Bel-7404細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移功能的影響。方法1.設計ITGA5基因的特異性sh RNA靶點,構建ITGA5基因sh RNA慢病毒載體并侵染Bel-7404細胞,構建基因穩(wěn)定沉默細胞系。用含非特異性序列的病毒載體作為陰性對照,未轉染的Bel-7404細胞作為空白對照。采用q PCR方法檢測Bel-7404細胞中ITGA5的m RNA水平變化,Western Blot方法檢測ITGA5蛋白水平的表達,以鑒定ITGA5基因沉默的效果。2.采用平板克隆形成實驗、流式細胞術、Transwell、細胞劃痕等實驗方法檢測ITGA5基因沉默后Bel-7404細胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移能力的變化。結果1.成功構建sh RNA-ITGA5慢病毒載體,侵染Bel-7404細胞,建立ITGA5穩(wěn)定沉默細胞系,q PCR及Western blot鑒定ITGA5基因沉默組的m RNA及蛋白質(zhì)表達水平均比空白、陰性對照組明顯降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2.平板克隆形成實驗結果顯示,基因沉默組比空白、陰性對照組的克隆形成率降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);Transwell結果顯示,基因沉默組細胞穿膜數(shù)比空白及陰性對照組顯著降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);細胞劃痕結果顯示,基因穩(wěn)定沉默組24h、48h細胞劃痕寬度均比比空白、陰性對照組寬,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);流式細胞術檢測細胞凋亡結果顯示,基因沉默組比空白及陰性對照組細凋亡率增加,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論:1.成功構建ITGA5基因sh RNA慢病毒表達載體及ITGA5穩(wěn)定沉默的肝癌Bel-7404細胞細胞系。2.ITGA5可能通過影響肝癌細胞的增殖、凋亡、侵襲遷移從而促進肝癌轉移。
【學位單位】：寧夏醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R735.7
【部分圖文】：

ITGA5-shRNA-1、ITGA5-shRNA-2、ITGA5-shRNA-3及陰性對照組ITGA5-shRNA-Negative細胞均可見明顯的綠色熒光GFP，使用嘌呤霉素篩選后約99%的細胞呈現(xiàn)出綠色熒光（如圖3），表明ITGA5的干擾序列及GFP基因已經(jīng)整合到目的細胞中，穩(wěn)定感染的細胞系構建成功。4.qPCR 和 Western blot 對穩(wěn)定感染細胞系 Bel-7404 的沉默效果鑒定qPCR 檢測 ITGA5 基因穩(wěn)定沉默細胞系 Bel-7404 中 ITGA5 的 mRNA表達情況。結果表明，ITGA5-shRNA-1、ITGA5-shRNA-2、ITGA5-shRNA-3組的 mRNA 相對表達量分別為（n=3, x±s）：（10.7±3.7）%、（16.7±1.5）%、

Western Blot 驗證 ITGA5 shRNA 慢病毒穩(wěn)定感染細胞系 Bel-7404 A5 蛋白質(zhì)的表達情況。用蛋白灰度分析軟件分析各組蛋白的相對表（n=3，x±s），3 組 ITGA5 基因穩(wěn)定沉默細胞系的 ITGA5 蛋白質(zhì)表白、陰性對照組明顯降低，結果均具有顯著性差異（P＜0.05）(如未處理組（100±0.6）%與陰性對照組（96.4±0.4）%的 ITGA5 蛋白平無顯著性差異（P=0.28）。綜合上述 RT-PCR 和 Western blot 檢測示：3 組 ITGA5 慢病毒干擾載體均有很好的沉默效果，選取沉默效的干擾組 ITGA5-shRNA-1 做后續(xù)實驗的工具細胞。

.ITGA5 對 Bel-7404 細胞體外遷移能力的影響為揭示ITGA5對Bel-7404人肝癌細胞體外遷移能力的影響，利用細胞劃實驗檢測ITGA5基因穩(wěn)定沉默后劃痕寬度變化。結果顯示：細胞劃痕24h、8h后，ITGA5基因穩(wěn)定沉默組細胞劃痕均比比空白、陰性對照組寬，差異統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而空白組和陰性對照組之間無明顯變化(如圖7)。結說明ITGA5基因沉默可減慢肝癌細胞的遷移能力。
【參考文獻】

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1 何彩霞;王亞婷;李鵬;郭亞妹;楊少奇;;整合素α5和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3在肝細胞癌中的表達及其臨床意義[J];中華消化雜志;2017年01期

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本文編號：2844054