目的構(gòu)建整合素α5(integrinα5,ITGA5)基因sh RNA慢病毒載體及ITGA5基因穩(wěn)定沉默的肝癌Bel-7404細(xì)胞系,檢測(cè)ITGA5基因?qū)el-7404細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移功能的影響。方法1.設(shè)計(jì)ITGA5基因的特異性sh RNA靶點(diǎn),構(gòu)建ITGA5基因sh RNA慢病毒載體并侵染Bel-7404細(xì)胞,構(gòu)建基因穩(wěn)定沉默細(xì)胞系。用含非特異性序列的病毒載體作為陰性對(duì)照,未轉(zhuǎn)染的Bel-7404細(xì)胞作為空白對(duì)照。采用q PCR方法檢測(cè)Bel-7404細(xì)胞中ITGA5的m RNA水平變化,Western Blot方法檢測(cè)ITGA5蛋白水平的表達(dá),以鑒定ITGA5基因沉默的效果。2.采用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell、細(xì)胞劃痕等實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)ITGA5基因沉默后Bel-7404細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移能力的變化。結(jié)果1.成功構(gòu)建sh RNA-ITGA5慢病毒載體,侵染Bel-7404細(xì)胞,建立ITGA5穩(wěn)定沉默細(xì)胞系,q PCR及Western blot鑒定ITGA5基因沉默組的m RNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平均比空白、陰性對(duì)照組明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,基因沉默組比空白、陰性對(duì)照組的克隆形成率降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);Transwell結(jié)果顯示,基因沉默組細(xì)胞穿膜數(shù)比空白及陰性對(duì)照組顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);細(xì)胞劃痕結(jié)果顯示,基因穩(wěn)定沉默組24h、48h細(xì)胞劃痕寬度均比比空白、陰性對(duì)照組寬,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示,基因沉默組比空白及陰性對(duì)照組細(xì)凋亡率增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1.成功構(gòu)建ITGA5基因sh RNA慢病毒表達(dá)載體及ITGA5穩(wěn)定沉默的肝癌Bel-7404細(xì)胞細(xì)胞系。2.ITGA5可能通過(guò)影響肝癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲遷移從而促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移。
【學(xué)位單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R735.7
【部分圖文】：

ITGA5-shRNA-1、ITGA5-shRNA-2、ITGA5-shRNA-3及陰性對(duì)照組ITGA5-shRNA-Negative細(xì)胞均可見(jiàn)明顯的綠色熒光GFP，使用嘌呤霉素篩選后約99%的細(xì)胞呈現(xiàn)出綠色熒光（如圖3），表明ITGA5的干擾序列及GFP基因已經(jīng)整合到目的細(xì)胞中，穩(wěn)定感染的細(xì)胞系構(gòu)建成功。4.qPCR 和 Western blot 對(duì)穩(wěn)定感染細(xì)胞系 Bel-7404 的沉默效果鑒定qPCR 檢測(cè) ITGA5 基因穩(wěn)定沉默細(xì)胞系 Bel-7404 中 ITGA5 的 mRNA表達(dá)情況。結(jié)果表明，ITGA5-shRNA-1、ITGA5-shRNA-2、ITGA5-shRNA-3組的 mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為（n=3, x±s）：（10.7±3.7）%、（16.7±1.5）%、

Western Blot 驗(yàn)證 ITGA5 shRNA 慢病毒穩(wěn)定感染細(xì)胞系 Bel-7404 A5 蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。用蛋白灰度分析軟件分析各組蛋白的相對(duì)表（n=3，x±s），3 組 ITGA5 基因穩(wěn)定沉默細(xì)胞系的 ITGA5 蛋白質(zhì)表白、陰性對(duì)照組明顯降低，結(jié)果均具有顯著性差異（P＜0.05）(如未處理組（100±0.6）%與陰性對(duì)照組（96.4±0.4）%的 ITGA5 蛋白平無(wú)顯著性差異（P=0.28）。綜合上述 RT-PCR 和 Western blot 檢測(cè)示：3 組 ITGA5 慢病毒干擾載體均有很好的沉默效果，選取沉默效的干擾組 ITGA5-shRNA-1 做后續(xù)實(shí)驗(yàn)的工具細(xì)胞。

.ITGA5 對(duì) Bel-7404 細(xì)胞體外遷移能力的影響為揭示ITGA5對(duì)Bel-7404人肝癌細(xì)胞體外遷移能力的影響，利用細(xì)胞劃實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ITGA5基因穩(wěn)定沉默后劃痕寬度變化。結(jié)果顯示：細(xì)胞劃痕24h、8h后，ITGA5基因穩(wěn)定沉默組細(xì)胞劃痕均比比空白、陰性對(duì)照組寬，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而空白組和陰性對(duì)照組之間無(wú)明顯變化(如圖7)。結(jié)說(shuō)明ITGA5基因沉默可減慢肝癌細(xì)胞的遷移能力。
【參考文獻(xiàn)】

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1 何彩霞;王亞婷;李鵬;郭亞妹;楊少奇;;整合素α5和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其臨床意義[J];中華消化雜志;2017年01期

2 趙鐵軍;倪偉海;鄭有芳;郭一孚;蔣歡樂(lè);徐怡;;慢病毒載體及其介導(dǎo)的RNA干擾在基因治療中的應(yīng)用研究[J];浙江師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2014年02期

3 李文賓;袁志強(qiáng);吳敏麗;;RNA干擾應(yīng)用研究現(xiàn)狀[J];中學(xué)生物教學(xué);2011年06期

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本文編號(hào)：2844054