目的:最近的流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明,在過(guò)去的50年中,男性不育發(fā)病率在不斷增加。男性不育的發(fā)病因素復(fù)雜,其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。富亮氨酸α2糖蛋白1(Leucine-rich-alpha-2-glycoprotein 1,LRG1),是膜相關(guān)富亮氨酸重復(fù)序列家族成員之一。LRG1基因在人卵巢癌、肝癌、肺癌等惡性腫瘤中都呈現(xiàn)異常表達(dá)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)Lrg1基因在小鼠睪丸中有表達(dá),提示其可能參與雄性生殖過(guò)程。因此本課題旨在探究Lrg1在小鼠睪丸組織中的定位和表達(dá)情況,通過(guò)敲除小鼠模型研究Lrg1基因在小鼠雄性生殖中的生物學(xué)功能,并對(duì)敲除小鼠睪丸轉(zhuǎn)錄譜表達(dá)變化進(jìn)行分析,以揭示Lrg1基因參與小鼠雄性生殖功能的調(diào)控機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法:1.免疫熒光和Western Blot方法檢測(cè)Lrg1基因的表達(dá)與定位。2.免疫熒光、PCR和Western Blot方法鑒定敲除小鼠Lrg1基因的表達(dá)情況。3.比較成年野生型對(duì)照小鼠和敲除小鼠體重、睪丸重量、精子數(shù)量、精子活力、精子形態(tài)以及睪丸形態(tài)學(xué)改變情況。4.通過(guò)ELISA方法檢測(cè)成年野生型對(duì)照小鼠和敲除小鼠血清睪酮和LH水平(n=6)。5.通過(guò)高通量測(cè)序方法,篩選出成年敲除小鼠與野生型對(duì)照小鼠睪丸組織中的差異表達(dá)基因,生物信息學(xué)方法進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.Western Blot和免疫熒光結(jié)果顯示,LRG1表達(dá)于小鼠睪丸組織,主要定位在精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞中。2.免疫熒光、PCR和Western Blot結(jié)果顯示Lrg1敲除小鼠模型構(gòu)建成功。3.敲除小鼠與野生型對(duì)照小鼠相比,體重、睪丸重量和附睪重量無(wú)明顯差異,但是敲除小鼠的精子數(shù)量和活力明顯低于野生型小鼠。睪丸組織形態(tài)學(xué)分析顯示敲除小鼠退化生精細(xì)胞數(shù)量增加。4.ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn),敲除小鼠與野生型對(duì)照小鼠相比血清LH水平升高,睪酮水平降低。5.高通量測(cè)序結(jié)果顯示差異基因主要集中在減數(shù)分裂、有絲分裂、染色體分離、精子發(fā)生、受精和代謝過(guò)程。此外,睪丸Lrg1敲除后有48個(gè)C2H2型鋅指蛋白家族成員表達(dá)下調(diào),17種miRNAs表達(dá)變化,說(shuō)明睪丸的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程發(fā)生障礙。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:我們研究揭示Lrg1基因在小鼠睪丸中參與調(diào)節(jié)精子發(fā)生與睪酮合成。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R698.2
【部分圖文】：

19spr/Cas9 技術(shù)敲除 Lrg1 基因小鼠鑒定。(A) Lrg1 基因序列中 gRNA 靶定位記；gRNA 序列用紅色下劃線標(biāo)記，PAM 序列標(biāo)記為紅色。 (B) Lrg1 敲除測(cè)序結(jié)果。(C) Lrg1 敲除小鼠和野生型小鼠睪丸組織中 LRG1 蛋白 WB rispr/Cas9-mediated Lrg1 gene modification in mice. (A) Schematic illustratarget site in the Lrg1 gene (blue arrow); the gRNAsequence is underlined

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文and the protospacer adjacent motif (PAM) sequence of the gRNA target site is marked in red.(B) Sequencing results from Lrg1 KO and WT mice. (C) Western blot analysis of LRG1expression in homogenized testis tissue from WT and Lrg1 KO mice.2.3 小鼠睪丸組織免疫熒光結(jié)果隨后小鼠睪丸組織免疫熒光結(jié)果顯示（圖 2），野生型小鼠睪丸的精原細(xì)胞和精母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有 LRG1 表達(dá)，而敲除小鼠睪丸中 LRG1 表達(dá)不明顯。說(shuō)明敲除小鼠模型成功建立。

圖 3：野生(A)和 Lrg1 (B)敲除小鼠精子形態(tài) HE 染色。Fig. 3: Sperm morphology in WT (A) and Lrg1 knockout (B) male mice. Sections werstained with hematoxylin and eosin.1 野生和 Lrg1敲除小鼠體重、睪丸和附睪尾重量、附睪尾精子計(jì)數(shù)以及精子活力分析able 1 Body weight, testis weight, epididymal weight, epididymal sperm counts, and spemotility for WT and Lrg1 knockout mice.WT Lrg1-/-ody weight(g) 30.32 ± 2.07 31.93 ± 2.36
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 白小英;金平;;LRG1及CA125在上皮性卵巢癌血清中的表達(dá)及其臨床意義[J];現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展;2013年02期

2 徐剛;武明花;李桂源;;神經(jīng)系統(tǒng)中富亮氨酸重復(fù)序列跨膜蛋白的功能研究進(jìn)展[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2012年04期

3 郭睿,薛社普,韓代書;精子發(fā)生相關(guān)基因的研究進(jìn)展[J];中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志;2004年01期

本文編號(hào)：2843058