目的:EphA3基因是人類最大受體酪氨酸激酶家族Eph(erythropoietin-producing human hepatocellular carcinoma,產(chǎn)促紅細(xì)胞生成素肝細(xì)胞癌受體)基因的成員之一,參與了生長、發(fā)育和腫瘤的發(fā)生、進展和轉(zhuǎn)移等方面。探討EphA3在結(jié)直腸癌中的表達與臨床病理資料的關(guān)系,以及對結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。方法:本研究檢測了四種腸癌細(xì)胞系、一種正常腸上皮細(xì)胞系和一組結(jié)直腸癌(164例包括腫瘤和正常組織)石蠟固定的組織標(biāo)本中EphA3蛋白表達水平,分析了EphA3表達與臨床病理指標(biāo)之間的相關(guān)性。為了探索EphA3表達下調(diào)的分子機制,采用甲基化特異性PCR檢測了四種腸癌細(xì)胞系中EphA3基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化狀態(tài);基因測序法分析EphA3四種常見的體細(xì)胞突變;定量PCR和熒光原位雜交技術(shù)(FISH)分析EphA3基因拷貝數(shù)情況。進一步轉(zhuǎn)染EphA3質(zhì)粒到EphA3表達丟失的HT29腸癌細(xì)胞,通過細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲力等體外實驗,分析EphA3在腸癌細(xì)胞中的功能。結(jié)果:EphA3蛋白在四種腸癌細(xì)胞系中全部丟失;組織中,EphA3在大多數(shù)腸癌組織中表達明顯低于在正常腸黏膜組織中的表達(P0,001)。將腸癌組織中EphA3免疫組織化學(xué)染色的評分與對應(yīng)的同一患者來源的正常腸黏膜免疫組化評分相比較,EphA3在82/164(50%)的腸癌腫瘤標(biāo)本中表達下調(diào),在52/164(31.7%)腸癌腫瘤標(biāo)本中無差異性,在30/164(18.3%)腸癌組織標(biāo)本中表達上調(diào)。EphA3的表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移負(fù)相關(guān)(P=0.014,r_s=-0.192),與TNM分期負(fù)相關(guān)(P=0.001,r_s=-0.260)。EphA3下調(diào)表達多見于老年人(P=0.013,r_s=0.193)。MS-PCR在四種腸癌細(xì)胞系中擴增出甲基化產(chǎn)物,未擴增出非甲基化產(chǎn)物,顯示存在EphA3啟動子區(qū)CpG島的甲基化。EphA3基因突變在四種腸癌細(xì)胞系中未被檢出。EphA3的基因拷貝數(shù)包括缺失和擴增在四種腸癌細(xì)胞系中也沒有發(fā)現(xiàn)異常。不表達EphA3的腸癌細(xì)胞HT29在轉(zhuǎn)染EphA3質(zhì)粒后,與空白對照和陰性對照組比較發(fā)現(xiàn),細(xì)胞增殖能力減弱、侵襲力降低以及凋亡率上升,并具有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論:EphA3在多數(shù)結(jié)直腸癌中表達下調(diào),EphA3啟動子區(qū)CpG島甲基化可能是其表達下調(diào)的分子機制。EphA3的表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期負(fù)相關(guān)。體外實驗表明,EphA3在腸癌細(xì)胞中起著抑癌基因作用。EphA3可能是一個潛在的結(jié)直腸癌淋巴轉(zhuǎn)移的預(yù)測指標(biāo),為結(jié)直腸癌靶向治療提供新的實驗依據(jù)。
【學(xué)位單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R735.34
【部分圖文】：

此結(jié)果表明本項目使用的 EphA3 抗體具有特異性。（×400）2、EphA3 在腸癌細(xì)胞系和正常腸上皮細(xì)胞系中的表達免疫細(xì)胞化學(xué)和 western blot 分析 EphA 3 蛋白在結(jié)腸癌細(xì)胞和正常腸上皮中的表達水平。EphA3 在腸癌 SW 480、SW 620、HT 29 和 HCT 116 細(xì)胞中，蛋白表達極低，而在正常腸上皮細(xì)胞 NCM460 中表達強陽性。22

染色呈現(xiàn)棕褐色。EphA3 在腸癌細(xì)胞系 SW480、SW620 和 HCT116中微弱表達，在 HT29 中為陰性。下圖為正常腸上皮細(xì)胞和腸癌細(xì)胞系 westernblot 檢測結(jié)果，與細(xì)胞免疫化學(xué)染色結(jié)果一致。3、EphA3 在結(jié)直腸癌組織和配對的正常腸粘膜細(xì)胞中的表達本項目共利用免疫組化染色檢測了 164 例結(jié)直腸癌組織標(biāo)本，分別觀察比較分析了同一患者組織切片上腫瘤細(xì)胞和癌旁正常黏膜細(xì)胞中 EphA3 受體蛋白的表達水平。EphA3 在正常黏膜和腫瘤組織中呈現(xiàn)多樣的表達方式，即從陰性到弱陽性、中等強度陽性、最后到強陽性。但是，在正常黏膜細(xì)胞中，強陽性的比例明顯高于腫瘤細(xì)胞中強陽性的數(shù)量。EphA3 蛋白在正常黏膜和腫瘤細(xì)胞中表達具有明顯差異性，在正常黏膜中總體為高表達，在腫瘤細(xì)胞中總體為低表達（P<0.001）�？傊�，EphA3 在腸癌細(xì)胞中的表達與同一患者的正常黏膜細(xì)胞表達相

南京醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文表 1. EphA3 在正常腸黏膜與腫瘤細(xì)胞的表達差異性分析EphA3 蛋白表達水平 P0/1+ 2+ 3+正常黏膜 50 50 64 < 0.001腫瘤 104 22 38
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本文編號：2841559