肌醇半乳糖苷酶(Galactinol synthase,GolS;EC 2.4.1.123)是棉籽低聚糖(RFOs)生物合成途徑中的第一個(gè)關(guān)鍵酶,該基因GolS(SRG)參與了植物多種逆境脅迫諸如:熱激(HS)、干旱、高鹽、茉莉酸(JA)等,但是其參與多種脅迫的分子機(jī)制尚不清楚,因此,本研究以模式植物擬南芥為材料,采用qPCR方法分析了基因AtSRG1等受JA、HS、JA+HS脅迫處理的表達(dá)量,凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(EMSA)驗(yàn)證了 AtMYC2能夠與AtSRG1基因的啟動(dòng)子結(jié)合,酵母雙雜交篩選出了 AtMYC2與AtHsf3蛋白互作,qPCR技術(shù)分析了轉(zhuǎn)錄因子AtMYC2、AtHsf3調(diào)控AtSRG1靶基因的表達(dá)情況,旨在解析轉(zhuǎn)錄因子AtMYC2與AtHsf3協(xié)同調(diào)控AtSRG1基因表達(dá)的分子機(jī)制,為植物抗逆改良與分子育種提供理論基礎(chǔ)與技術(shù)支持。具體結(jié)果如下:1.基因AtSRG1顯著受JA、HS、JA+HS誘導(dǎo)表達(dá),采用qRT-PCR技術(shù)結(jié)合GUS染色方法定性、定量分析了AtSRG1及其啟動(dòng)子受JA、HS、JA+HS三種脅迫處理不同時(shí)間的相對表達(dá)量,結(jié)果表明,基因AtSRG1不僅極其顯著地受熱激誘導(dǎo)表達(dá),還顯著受JA及JA+HS誘導(dǎo)表達(dá)。2.轉(zhuǎn)錄因子AtMYC2調(diào)控AtSRG1表達(dá),采用凝膠阻抑實(shí)驗(yàn)(EMSA)分析了轉(zhuǎn)錄因子AtMYC2與基因AtSRG1啟動(dòng)子G-box順式元件的結(jié)合情況,結(jié)果表明AtMYC2蛋白能夠與G-box特異結(jié)合。同時(shí),基因AtSRG1在突變體myc2/myc3/myc4中受JA處理后的表達(dá)量相對野生型擬南芥,顯著下降,說明在JA處理下,AtMYC2調(diào)控了基因AtSRG1表達(dá)。3.AtMYC2與AtHsf3蛋白互作,采用酵母雙雜交分析了 AtMYC2與AtHsf3的蛋白互作,將Hsf3不同片段構(gòu)建至pAS2.1載體上,分別與AtMYC2-pACT載體,共轉(zhuǎn)化酵母Y187,結(jié)果發(fā)現(xiàn)AtHsf3全長具有轉(zhuǎn)錄激活活性,自激活結(jié)構(gòu)域在410-459之間,并且AtHsf3與AtMYC2蛋白互作,互作結(jié)構(gòu)域是AtHsf3(410-459)。4.獲得了四突變體myc2/3/4/hsf3純合子,以三突變體myc2/3/4為母本,單突變體hsf3為父本,雜交、擴(kuò)繁得到F2代擬南芥,經(jīng)PCR檢測,共獲得了四突變體myc2/myc3/wyc4/hsf3純合子15個(gè)單株,并且四突變體的表型與野生型擬南芥的表型沒有顯著差別,只是種莢內(nèi)的種子數(shù)量顯著減少。5.JA、HS及JA+HS對突變體根長的影響,分析了 JA、HS及JA+HS對WT、hsf3、myc2/myc3/myc4、myc2/myc3/myc4/hsf3根長的影響,結(jié)果表明,JA極其顯著地抑制了野生型和突變體hsf3的根長,根長抑制率為85%,三突變體myc2/3/4和四突變體myc2/3/4/hsf3的根長抑制率為34%;而熱激對野生型和突變體hsf3、myc2/myc3/myc4、myc2/myc3/myc4/hsf3的影響差異不顯著。6.qPCR方法分析基因AtSRG1在突變體中的表達(dá)量,采用qPCR方法分析了基因AtSRG1在單突變體hsf3、三突變體myc2/3/4、四突變體myc2/3/4/hsf3中受JA、HS、JA+HS誘導(dǎo)表達(dá)量,結(jié)果表明,JA處理下,AtMYC2調(diào)控了基因AtSRG1表達(dá),在HS處理下,AtHsf3等轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控了基因AtSRG1表達(dá),在JA+HS處理下,AtMYC2、AtHsf3等轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控了基因AtSRG1表達(dá)。綜上所述,本研究以創(chuàng)制的擬南芥四突變體myc2/3/4/hsf3等為材料,采用qPCR方法分析了基因AtSRG1等顯著受JA、HS、JA+HS誘導(dǎo)表達(dá),利用EMSA實(shí)驗(yàn)證實(shí)了 AtMYC2能夠與AtSRG1基因的啟動(dòng)子結(jié)合,運(yùn)用酵母雙雜交方法篩選出了 AtMYC2與AtHsf3蛋白互作,qPCR方法分析了轉(zhuǎn)錄因子AtMYC2、AtHsf3調(diào)控AtSRG1靶基因的表達(dá)情況,解析了轉(zhuǎn)錄因子AtMYC2與AtHsf3協(xié)同調(diào)控AtSRG1基因表達(dá)的分子機(jī)制,為植物抗逆改良與分子育種提供理論基礎(chǔ)與技術(shù)支持。
【學(xué)位單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士后
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：Q943.2
【部分圖文】：

為進(jìn)一步分析基因啟動(dòng)子活性，以２周齡轉(zhuǎn)基因仏ｒｏ－ＧＵＳ??擬南芥幼苗為材料，分別進(jìn)行３７°Ｃ?（ＨＳ）、ＪＡ、ＨＳ＋ＪＡ處理，ＧＵＳ染色，結(jié)果??見圖２，在正常條件下僅在根部表達(dá)，莖葉中沒有表達(dá)；在ＪＡ處理下，??在根、壟中大量表達(dá)，在葉片中少量表達(dá)，并且隨著ＪＡ處理時(shí)間的??延長，ＧＵＳ染色越深；在３７°Ｃ熱激處理下，在根莖葉中大量表達(dá)，??ＧＵＳ顏色明顯比受ＪＡ處理下的深；在ＪＡ＋ＨＳ處理下，也在根莖葉中??大量表達(dá)，在協(xié)同處理１２?ｈ、２４?ｈ時(shí)，ＧＵＳ顏色明顯比ＪＡ和ＨＳ單獨(dú)處理時(shí)深。??由此可見，基因也Ｓ７？Ｇ７啟動(dòng)子顯著受ＪＡ、ＨＳ、ＪＡ＋ＨＳ誘導(dǎo)表達(dá)。??對基因也Ｓ７？Ｇ７啟動(dòng)子進(jìn)行ＧＵＳ定性測定的同時(shí)，進(jìn)行了?ＧＵＳ定量分析，??結(jié)果見圖３，在ＪＡ處理下，ＧＵＳ活性從３０持續(xù)上調(diào)至１２０；在熱激處理下，??ＧＵＳ活性從１００持續(xù)上調(diào)至１２０；在ＪＡ＋ＨＳ處理下

八１１＾〇２基因１－１０１７?５卩序列構(gòu)建至卩￡１３（＾載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌８１＾１，挑取??陽性單克隆菌落進(jìn)行ＩＰＴＧ誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳分析，結(jié)果見??圖５，ＡｔＭＹＣ２融合蛋白分子量為４４?ｋＤａ，單克�。常刀加心康牡鞍状罅勘磉_(dá)。??采用Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂親和層析對大量誘導(dǎo)表達(dá)的粗蛋白進(jìn)行純化，得到純化蛋白，??結(jié)果見圖５Ｂ，純化后的蛋白產(chǎn)物在４４?ｋＤａ左右有清晰的條帶。將純化的蛋白??ＡｔＭＹＣ２進(jìn)行ｗｅｓｔｅｒｎ雜交，結(jié)果見圖５Ｃ，抗Ｈｉｓ標(biāo)簽兔單克隆抗體可以和純化??后的ＡｔＭＹＣ２融合蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，且與預(yù)期大小４４ｋＤａ左右相一致，說??明純化的融合蛋白是帶有Ｈｉｓ標(biāo)簽的目的蛋白。??４Ａ?４Ｂ?４Ｃ??Ｍ?１?２?３?４?５?Ｍ?１?２?３?４?５?，?７?８?Ｍ?１??ｓ〇ｋＤ?—?誦＿?ａ?＇?…ｎｚ?一，?＇??６０?ｋＤ?＇?，灰…?？?■?心、??——＾１?ｓ〇ｋＤ?—ｍ??■?ｎ?＊?■?—?４０?ｋＤ??３０?ｋＤ?—戀?Ｑ?３０ｋＤ?—?口?：?％（’、、??２０ｋＤ?一…署Ｓ?細(xì)一?：獅？．??圖５原核表達(dá)蛋白ＡｔＭＹＣ２的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ檢測??Ｆｉｇ．?５?Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ＡｔＭＹＣ２?ｉｎ?Ｅ．?ｃｏｌｉ?ｓｔｒａｉｎ?ＢＬ２１??圖５Ａ

圖７基因Ａ５７？Ｇ／在突變體中的表達(dá)量??Ｆｉｇ．?７?Ｔｈｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｐａｔｔｅｒｎｓ?ｏｆ?ＡｔＳＲＧｌ?ｉｎ?ｍｕｔａｎｔ?ｍｙｃ２／３／４?ｗｉｔｈ?ＭｅＪＡ?ｔｒｅａｔｍＡｔＭＹＣ２與ＡｔＨｓｆ３蛋白互作??由前期實(shí)驗(yàn)己證明，ＡｔＭＹＣ２能夠結(jié)合基因也Ｓ７？Ｇ７啟動(dòng)子的Ｇ－ｂｏ而調(diào)控其表達(dá)，己有文獻(xiàn)報(bào)道熱擊轉(zhuǎn)錄因子ＡｔＨｓｆ３也能夠結(jié)合基子的ＨＳＥ順式元件從而調(diào)控其表達(dá)，那么，轉(zhuǎn)錄因子ＡｔＭＹＣ２蛋白互作呢？為此，采用酵母雙雜交分析了?ＡｔＭＹＣ２與ＡｔＨｓｆ３的于轉(zhuǎn)錄因子ＡｔＨｓｆ３具有自激活活性，因此設(shè)計(jì)了不同的片段載體上，見圖８Ａ，轉(zhuǎn)化酵母Ｙ１８７，涂布在雙缺平板上ＳＤ／－Ｌｅｕ－Ｔ單克隆３－５個(gè)，與液體ＳＤ／－Ｌｅｕ－Ｔｒｐ中過夜培養(yǎng)，涂布在添加不同三缺平板上ＳＤ／－Ｌｅｕ－Ｔｒｐ－Ｈｉｓ，由結(jié)果（圖８Ｂ）看出，含有ＡｔＨｓｆ－－
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1 孫占敏;擬南芥AtMYC2和AtHsf3協(xié)同調(diào)控基因AtSRG1表達(dá)的分子機(jī)制[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2018年

本文編號：2840939