梨小食心蟲Grapholitha molesta(Busck)是一種世界性的蛀果類害蟲。以幼蟲蛀食多種薔薇科果樹的嫩梢和果實(shí)。過(guò)度依賴化學(xué)農(nóng)藥防治梨小食心蟲的效果并不理想,且殺傷天敵、污染環(huán)境、導(dǎo)致農(nóng)藥殘留和抗性產(chǎn)生。Bt殺蟲蛋白(insecticidal crystal proteins,ICPs)對(duì)靶標(biāo)昆蟲具有高度的特異性并且對(duì)人和牲畜無(wú)害,利用Bt防治梨小食心蟲具有高效、安全、無(wú)污染的特點(diǎn),符合綠色無(wú)公害果品的要求,具有廣闊的應(yīng)用前景。Bt主要通過(guò)與昆蟲中腸刷狀緣膜囊泡(BBMV)上受體結(jié)合而發(fā)揮殺蟲作用,許多鱗翅目昆蟲中腸上的Bt受體已被發(fā)現(xiàn)并且深入研究,但對(duì)梨小食心蟲Bt受體的研究幾乎未見報(bào)道。鑒于此,本研究以對(duì)Bt毒素敏感的梨小食心蟲為研究對(duì)象,采用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)梨小食心蟲中腸Bt受體氨肽酶N3 GmolAPN3基因進(jìn)行克隆和表達(dá);通過(guò)熒光定量分析了該基因在梨小食心蟲不同發(fā)育時(shí)期,幼蟲不同組織中的表達(dá)量;運(yùn)用生物測(cè)定方法測(cè)定Bt Cry1Ac毒素對(duì)梨小食心蟲2齡幼蟲的毒力,比較梨小食心蟲幼蟲取食不同濃度Cry1Ac毒素后GmolAPN3基因的表達(dá)量變化;利用RNAi技術(shù)對(duì)梨小食心蟲中腸GmolAPN3基因進(jìn)行干擾。研究結(jié)果對(duì)明確Bt作用機(jī)理、研發(fā)防治梨小食心蟲高效Bt制劑和轉(zhuǎn)Bt基因作物具有一定的指導(dǎo)價(jià)值。取得的主要研究結(jié)果如下:1.利用PCR結(jié)合RACE技術(shù),獲得了梨小食心蟲GmolAPN3基因的cDNA全長(zhǎng)序列。該基因序列全長(zhǎng)為3 249bp,開放閱讀框?yàn)? 021bp,編碼1 006個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量和等電點(diǎn)分別為113.9KDa和4.72,推導(dǎo)的氨基酸序列具有鱗翅目昆蟲氨肽酶N典型結(jié)構(gòu)特征,即含有9個(gè)N-糖基化位點(diǎn)和7個(gè)O-糖基化位點(diǎn),保守結(jié)構(gòu)GAMEN,鋅結(jié)合位點(diǎn)HEXXH(X)_(18)E,N-末端具有19個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列,C-末端具有17個(gè)氨基酸的糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定信號(hào)肽,有GluZincin superfamily Aminopeptidase N domain和ERAP1-like C-terminal domain 2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域,具有Bt受體結(jié)構(gòu)特征。系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明GmolAPN3與其他鱗翅目昆蟲的APN3在同一分支上,同為APN家族的Class3類,與大螟、小菜蛾、棉鈴蟲和澳洲棉鈴蟲的親緣關(guān)系較近。2.對(duì)GmolAPN3蛋白進(jìn)行分段原核表達(dá),獲得了4個(gè)片段原核表達(dá)的最佳條件。3.通過(guò)Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),GmolAPN3基因在梨小食心蟲各個(gè)發(fā)育階段均可以表達(dá),幼蟲期基因的表達(dá)量顯著高于其他時(shí)期,尤其在2齡幼蟲中的表達(dá)量最高,在卵期和蛹期的表達(dá)量最低,此外,GmolAPN3基因在梨小食心蟲幼蟲中腸中的表達(dá)量最高。4.用不同濃度的Bt Cry1Ac毒素蛋白飼喂梨小食心蟲2齡幼蟲,獲得Cry1Ac毒素對(duì)梨小食心蟲毒力方程:y=-1.046+1.014x,LC_(50)為10.768μg/g。5.用不同濃度Bt Cry1Ac毒素飼喂梨小食心蟲2齡幼蟲,檢測(cè)GmolAPN3基因在不同時(shí)間段的表達(dá)量,結(jié)果表明在低濃度(1.592μg/g、3.273μg/g)Cry1Ac毒素處理下,梨小食心蟲2齡幼蟲GmolAPN3基因的表達(dá)量均低于對(duì)照組,且呈先降低后升高的趨勢(shì),幼蟲死亡率低。而在高濃度(10.768μg/g、35.427μg/g)毒素處理下,GmolAPN3基因表達(dá)量高于對(duì)照組,呈短暫升高后降低的趨勢(shì),幼蟲死亡率高。6.用不同濃度的dsAPN3飼喂梨小食心蟲2齡幼蟲后發(fā)現(xiàn),7μg/g的dsAPN3對(duì)GmolAPN3基因的干擾效率達(dá)到了60%,用Cry1Ac毒素飼喂GmolAPN3基因被干擾后的幼蟲,其死亡率顯著降低,初步推斷梨小食心蟲GmolAPN3具有與Bt Cry1Ac毒素結(jié)合的受體功能。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S433
【部分圖文】：

2.3 梨小食心蟲 GmolAPN3 蛋白的分段原核表達(dá)2.3.1 梨小食心蟲中腸組織的收集、RNA 的提取以及 cDNA 第一鏈的合成方法同 2.2.1，2.2.2，2.2.32.3.2 GmolAPN3 基因片段引物的設(shè)計(jì)根據(jù)梨小食心蟲 GmolAPN3 氨基酸序列的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，將 GmolAPN3 分成以下 4 個(gè)部分，其中需要去掉 N-端的信號(hào)肽序列，C-端的 GPI 錨定序列，根據(jù)氨基酸片段尋找對(duì)應(yīng)的基因序列并設(shè)計(jì)分段克隆的引物。

圖 3.1 梨小食心蟲中腸 RNA 瓊脂糖凝膠電泳Fig. 3.1 Agarose gel electrophoresis of RNA from midgut of Grapholith 提取的梨小食心蟲中腸 RNA 經(jīng)過(guò) 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢 5S 三條帶且 28S 及 18S 條帶清晰（圖 3.1），表明所提取的 1.9-2.0 之間，所提取 RNA 的完整性及純度已達(dá)到反轉(zhuǎn)錄

圖 3.4 GluZincin superfamily Aminopeptidase N domain（A）、ERAP1-like C-terminal domain（B）和 GmolAPN3（C）的三維結(jié)構(gòu)Fig. 3.4 The 3D structure of GluZincin superfamily Aminopeptidase N domain(A),ERAP1-like C-terminal domain（B）and GmolAPN3（C）紅色: GluZincin superfamily Aminopeptidase N domain; 藍(lán)色: ERAP1-like C-terminal domain; 綠色:鋅結(jié)合位點(diǎn); 黑色: 其他部分.Red: GluZincin superfamily Aminopeptidase N domain; Blue: ERAP1-like C-terminal domain; Green:Zinc binding site; Black: Other parts.結(jié)構(gòu)域分析表明，GmolAPN3 氨肽酶含有 GluZincin superfamily Aminopeptidase Ndomain（66—537 位氨基酸）和 ERAP1-like C-terminal domain（609-912 位氨基酸）2 個(gè)保守結(jié)構(gòu)域（圖 3.3），并且在 GluZincin superfamily Aminopeptidase N domain 的第373—396 位氨基酸處有鋅指結(jié)構(gòu)373HEXXH(X)18E396，是酶的活性位點(diǎn)。三維結(jié)構(gòu)模型（圖3.4）顯示，在 GluZincin superfamily Aminopeptidase N domain 富含 α 螺旋和 β 折疊（圖3.4: A）；如圖 3.4: B 所示，ERAP1-like C-terminal domain 主要由 16 個(gè) α 螺旋組成了 8
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2840928