本研究中我們利用水稻基因芯片技術(shù),通過(guò)比較野生型水稻(Wide type,WT)和光敏色素B突變體水稻(Mutant,phyB)基因表達(dá)圖譜,我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)受光敏色素B(Phytochrome,phyB)介導(dǎo)并被光敏色素相互作用因子OsPIL15基因調(diào)控的CCCH型中包含植物特有的TZF基序的水稻鋅指蛋白基因,其在phyB中的表達(dá)水平顯著高于WT,在分析該基因編碼的蛋白、分析進(jìn)化樹及預(yù)測(cè)啟動(dòng)區(qū)等一系列生物信息學(xué)特征時(shí),我們發(fā)現(xiàn)該水稻鋅指蛋白基因與擬南芥的鋅指蛋白基因SOMNUS是同源基因,將其命名為OsZFL1。為了探究OsZFL1基因在光敏色素介導(dǎo)的光反應(yīng)中的作用,我們研究了該基因在水稻生長(zhǎng)和發(fā)育中的作用。在本研究中,我們首先分析了該基因的生物信息學(xué)特征,其次分析了該基因的表達(dá)模式,然后構(gòu)建了該基因的過(guò)表達(dá)載體和CRISPR/Cas9載體,并分別獲得了該基因的過(guò)表達(dá)株系和CRISPR/Cas9株系,初步分析了OsZFL1株系的生長(zhǎng)和發(fā)育特征。具體研究結(jié)果如下:(1)對(duì)OsZFL1基因生物信息學(xué)的基因序列、進(jìn)化樹、啟動(dòng)區(qū)預(yù)測(cè)等分析研究表明,OsZFL1基因編碼的蛋白是含有TZF基序的CCCH型鋅指蛋白;該基因和已報(bào)道的擬南芥SOMNUS基因是同源基因;該基因啟動(dòng)區(qū)內(nèi)包含與光調(diào)控有關(guān)的元件Sp1,與植物激素脫落酸(ABA)反應(yīng)有關(guān)的元件ABRE、motifⅡb,還有未知元件GC-motif,因此推測(cè)OsZFL1基因的表達(dá)可能受光以及植物激素ABA的調(diào)控。(2)對(duì)OsZFL1基因的表達(dá)模式研究分析表明,相對(duì)于苗期的根和葉片,OsZFL1基因在WT水稻干種子中表達(dá)量最高,當(dāng)干種子吸漲后,OsZFL1的表達(dá)水平迅速下降,推測(cè)OsZFL1基因可能與種子萌發(fā)、發(fā)育有關(guān);光周期實(shí)驗(yàn)顯示:WT中OsZFL1基因在光期14:00時(shí)表達(dá)降低,而在暗期表達(dá)沒(méi)有明顯差異,說(shuō)明OsZFL1基因的表達(dá)并不受光周期的影響。(3)我們構(gòu)建了OsZFL1的過(guò)表達(dá)(OsZFL1-OX)載體,成功獲得了OsZFL1-OX轉(zhuǎn)基因株系,鑒定了OsZFL1-OX株系不同插入位點(diǎn)。(4)研究在OsZFL1-OX株系中ABA代謝途徑關(guān)鍵基因的表達(dá),RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,OsZFL1基因過(guò)表達(dá)下調(diào)ABA合成代謝基因OsZEP、OsNCED1、OsNCED6基因的表達(dá),上調(diào)ABA降解代謝基因OsABA8ox1、OsABA8ox2基因的表達(dá),據(jù)此推測(cè)OsZFL1基因可能影響ABA的代謝途徑。(5)研究在OsZFL1-OX株系中植物激素赤霉素(GA)代謝途徑關(guān)鍵基因的表達(dá),RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,OsZFL1基因過(guò)表達(dá)上調(diào)GA3ox1、GA2ox3、GA2ox5基因的表達(dá),據(jù)此推測(cè)OsZFL1基因可能參與水稻的GA信號(hào)途徑。(6)通過(guò)分析水稻PIFs對(duì)OsZFL1表達(dá)水平的影響,我們發(fā)現(xiàn)在暗生長(zhǎng)條件下,OsZFL1基因在所有OsPIL-OX轉(zhuǎn)基因株系中均上調(diào)表達(dá)。而在光照條件下,除了OsPIL15株系中OsZFL1基因的表達(dá)水平較高,其它水稻PIFs過(guò)表達(dá)株系中的OsZFL1表達(dá)水平與WT差異不明顯。研究結(jié)果表明,PIFs正調(diào)控OsZFL1的表達(dá),而光信號(hào)消除了這種正調(diào)控作用,說(shuō)明光敏色素互作因子OsPIL15基因可能調(diào)控OsZFL1基因的表達(dá)。(7)我們觀察了光照和黑暗處理3天后OsPIL15和OsZFL1過(guò)表達(dá)種子的萌發(fā)情況,與WT相比,OsPIL15在黑暗下種子萌發(fā)不好,但OsZFL1完全沒(méi)有差異,說(shuō)明OsPIL15在黑暗下的萌發(fā)表型不是由于OsZFL1基因造成的。(8)我們構(gòu)建了OsZFL1-CRISPR/Cas9載體,成功獲得了3個(gè)靶點(diǎn)的OsZFL1-CRISPR/Cas9轉(zhuǎn)基因株系,分析了OsZFL1-CRISPR/Cas9各單株DNA序列。(9)為了分析OsZFL1基因?qū)獾拿舾行?我們分別檢測(cè)了連續(xù)紅光和遠(yuǎn)紅光處理后WT和OsZFL1株系的胚芽鞘伸長(zhǎng)和第一不完全葉的受抑制情況。OsZFL1-OX株系的胚芽鞘及第一不完全葉受紅光和遠(yuǎn)紅光照射處理后,與WT差異不明顯,但是OsZFL1-CRISPR/Cas9株系的胚芽鞘及第一不完全葉受紅光和遠(yuǎn)紅光處理后,相對(duì)長(zhǎng)度較WT長(zhǎng),說(shuō)明OsZFL1-CRISPR/Cas9株系對(duì)紅光和遠(yuǎn)紅光的敏感性降低。(10)分析OsZFL1-OX株系對(duì)鹽脅迫和干旱脅迫的抗性,研究表明OsZFL1基因能瞬時(shí)提高水稻鹽脅迫耐性。(11)通過(guò)觀察幼苗期WT和OsZFL1-OX株系的株高表型,我們發(fā)現(xiàn)幼苗期OsZFL1-OX株系的株高始終低于WT。(12)我們統(tǒng)計(jì)了成熟時(shí)期生長(zhǎng)發(fā)育的OsZFL1-CRISPR/Cas9株系的重要農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)包括株高、粒數(shù)、小花數(shù)、穗長(zhǎng)、一級(jí)枝梗數(shù)、有效分蘗數(shù)和結(jié)實(shí)率,結(jié)果分析表明,與WT相比,OsZFL1-CRISPR/Cas9株系導(dǎo)致單株粒數(shù)減少,但分蘗數(shù)增多,結(jié)實(shí)率與WT相差不大。通過(guò)上述研究結(jié)果,我們初步探究了OsZFL1基因在水稻生長(zhǎng)發(fā)育中的作用。同時(shí)結(jié)合已報(bào)道的擬南芥SOMNUS基因的功能,我們初步探究了水稻SOMNUS同源基因OsZFL1基因在光敏色素介導(dǎo)光反應(yīng)中的作用,為進(jìn)一步分析OsZFL1基因在水稻生長(zhǎng)發(fā)育中的作用奠定了基礎(chǔ),為深入解析光敏色素介導(dǎo)的光信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)提供新的信息。
【學(xué)位單位】：煙臺(tái)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S511
【文章目錄】：
摘要
Abstract
中英文符號(hào)說(shuō)明
第一部分 文獻(xiàn)綜述
    1 CCCH鋅指蛋白
        1.1 CCCH鋅指蛋白的結(jié)構(gòu)特征
        1.2 CCCH鋅指蛋白在植物生長(zhǎng)中的功能
    2 光敏色素在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的作用
        2.1 光敏色素對(duì)幼苗去黃化的調(diào)控
        2.2 光敏色素對(duì)植物株型和育性的調(diào)控
        2.3 光敏色素對(duì)植物光周期現(xiàn)象的調(diào)控
        2.4 光敏色素參與調(diào)控植物對(duì)生物脅迫的抗性
        2.5 光敏色素參與調(diào)控植物對(duì)非生物脅迫的抗性及ABA代謝途徑
    3 PIFs在光敏色素介導(dǎo)的光信號(hào)傳導(dǎo)中的作用
    4 本論文的研究意義
    5 技術(shù)路線
第二部分 實(shí)驗(yàn)論文
    第一章 通過(guò)生物信息學(xué)分析OsZFL1基因和OsZFL1蛋白
        1 材料與方法
        2 結(jié)果與分析
            2.1 OsZFL1基因的開放閱讀框
            2.2 OsZFL1蛋白序列的結(jié)構(gòu)
            2.3 OsZFL1蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析
            2.4 OsZFL1啟動(dòng)子區(qū)上游元件的預(yù)測(cè)
        3 討論
    第二章 OsZFL1基因的表達(dá)模式分析
        1 材料與方法
            1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.2 方法
        2 結(jié)果與分析
            2.1 OsZFL1基因在種子、葉和根的表達(dá)量分析
            2.2 光周期對(duì)OsZFL1基因表達(dá)的影響
        3 討論
    第三章 OsZFL1在水稻生長(zhǎng)發(fā)育中的作用
        1 材料與方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2 結(jié)果與分析
            2.1 OsZFL1基因的克隆
            2.2 OsZFL1轉(zhuǎn)基因株系中OsZFL1基因的插入位點(diǎn)檢測(cè)及表達(dá)水平檢測(cè)
            2.3 OsZFL1基因可能影響水稻的ABA途徑
            2.4 OsZFL1基因參與調(diào)控GA信號(hào)途徑
            2.5 OsPIL-OX水稻中OsZFL1基因的表達(dá)水平的分析
            2.6 OsZFL1基因?qū)sPIL15過(guò)表達(dá)種子萌發(fā)的影響
            2.7 OsZFL1-CRISPR/Cas9植物表達(dá)載體的構(gòu)建
            2.8 OsZFL1-OX株系和OsZFL1-CRISPR/Cas9株系的光敏感性分析
            2.9 OsZFL1株系對(duì)鹽脅迫和干旱脅迫的抗性分析調(diào)節(jié)
            2.10 OsZFL1基因調(diào)節(jié)水稻苗期的株高
            2.11 OsZFL1基因?qū)λ敬筇镛r(nóng)藝性狀的影響
        3 討論
    第四章 水稻光敏色素B抗體的制備及其特異性檢測(cè)
第三部分 總結(jié)
論文的主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)
下一步的工作計(jì)劃
參考文獻(xiàn)
致謝
附錄

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2840712