本研究中我們利用水稻基因芯片技術,通過比較野生型水稻(Wide type,WT)和光敏色素B突變體水稻(Mutant,phyB)基因表達圖譜,我們發(fā)現了一個受光敏色素B(Phytochrome,phyB)介導并被光敏色素相互作用因子OsPIL15基因調控的CCCH型中包含植物特有的TZF基序的水稻鋅指蛋白基因,其在phyB中的表達水平顯著高于WT,在分析該基因編碼的蛋白、分析進化樹及預測啟動區(qū)等一系列生物信息學特征時,我們發(fā)現該水稻鋅指蛋白基因與擬南芥的鋅指蛋白基因SOMNUS是同源基因,將其命名為OsZFL1。為了探究OsZFL1基因在光敏色素介導的光反應中的作用,我們研究了該基因在水稻生長和發(fā)育中的作用。在本研究中,我們首先分析了該基因的生物信息學特征,其次分析了該基因的表達模式,然后構建了該基因的過表達載體和CRISPR/Cas9載體,并分別獲得了該基因的過表達株系和CRISPR/Cas9株系,初步分析了OsZFL1株系的生長和發(fā)育特征。具體研究結果如下:(1)對OsZFL1基因生物信息學的基因序列、進化樹、啟動區(qū)預測等分析研究表明,OsZFL1基因編碼的蛋白是含有TZF基序的CCCH型鋅指蛋白;該基因和已報道的擬南芥SOMNUS基因是同源基因;該基因啟動區(qū)內包含與光調控有關的元件Sp1,與植物激素脫落酸(ABA)反應有關的元件ABRE、motifⅡb,還有未知元件GC-motif,因此推測OsZFL1基因的表達可能受光以及植物激素ABA的調控。(2)對OsZFL1基因的表達模式研究分析表明,相對于苗期的根和葉片,OsZFL1基因在WT水稻干種子中表達量最高,當干種子吸漲后,OsZFL1的表達水平迅速下降,推測OsZFL1基因可能與種子萌發(fā)、發(fā)育有關;光周期實驗顯示:WT中OsZFL1基因在光期14:00時表達降低,而在暗期表達沒有明顯差異,說明OsZFL1基因的表達并不受光周期的影響。(3)我們構建了OsZFL1的過表達(OsZFL1-OX)載體,成功獲得了OsZFL1-OX轉基因株系,鑒定了OsZFL1-OX株系不同插入位點。(4)研究在OsZFL1-OX株系中ABA代謝途徑關鍵基因的表達,RT-qPCR實驗結果表明,OsZFL1基因過表達下調ABA合成代謝基因OsZEP、OsNCED1、OsNCED6基因的表達,上調ABA降解代謝基因OsABA8ox1、OsABA8ox2基因的表達,據此推測OsZFL1基因可能影響ABA的代謝途徑。(5)研究在OsZFL1-OX株系中植物激素赤霉素(GA)代謝途徑關鍵基因的表達,RT-qPCR實驗結果表明,OsZFL1基因過表達上調GA3ox1、GA2ox3、GA2ox5基因的表達,據此推測OsZFL1基因可能參與水稻的GA信號途徑。(6)通過分析水稻PIFs對OsZFL1表達水平的影響,我們發(fā)現在暗生長條件下,OsZFL1基因在所有OsPIL-OX轉基因株系中均上調表達。而在光照條件下,除了OsPIL15株系中OsZFL1基因的表達水平較高,其它水稻PIFs過表達株系中的OsZFL1表達水平與WT差異不明顯。研究結果表明,PIFs正調控OsZFL1的表達,而光信號消除了這種正調控作用,說明光敏色素互作因子OsPIL15基因可能調控OsZFL1基因的表達。(7)我們觀察了光照和黑暗處理3天后OsPIL15和OsZFL1過表達種子的萌發(fā)情況,與WT相比,OsPIL15在黑暗下種子萌發(fā)不好,但OsZFL1完全沒有差異,說明OsPIL15在黑暗下的萌發(fā)表型不是由于OsZFL1基因造成的。(8)我們構建了OsZFL1-CRISPR/Cas9載體,成功獲得了3個靶點的OsZFL1-CRISPR/Cas9轉基因株系,分析了OsZFL1-CRISPR/Cas9各單株DNA序列。(9)為了分析OsZFL1基因對光的敏感性,我們分別檢測了連續(xù)紅光和遠紅光處理后WT和OsZFL1株系的胚芽鞘伸長和第一不完全葉的受抑制情況。OsZFL1-OX株系的胚芽鞘及第一不完全葉受紅光和遠紅光照射處理后,與WT差異不明顯,但是OsZFL1-CRISPR/Cas9株系的胚芽鞘及第一不完全葉受紅光和遠紅光處理后,相對長度較WT長,說明OsZFL1-CRISPR/Cas9株系對紅光和遠紅光的敏感性降低。(10)分析OsZFL1-OX株系對鹽脅迫和干旱脅迫的抗性,研究表明OsZFL1基因能瞬時提高水稻鹽脅迫耐性。(11)通過觀察幼苗期WT和OsZFL1-OX株系的株高表型,我們發(fā)現幼苗期OsZFL1-OX株系的株高始終低于WT。(12)我們統(tǒng)計了成熟時期生長發(fā)育的OsZFL1-CRISPR/Cas9株系的重要農藝性狀數據包括株高、粒數、小花數、穗長、一級枝梗數、有效分蘗數和結實率,結果分析表明,與WT相比,OsZFL1-CRISPR/Cas9株系導致單株粒數減少,但分蘗數增多,結實率與WT相差不大。通過上述研究結果,我們初步探究了OsZFL1基因在水稻生長發(fā)育中的作用。同時結合已報道的擬南芥SOMNUS基因的功能,我們初步探究了水稻SOMNUS同源基因OsZFL1基因在光敏色素介導光反應中的作用,為進一步分析OsZFL1基因在水稻生長發(fā)育中的作用奠定了基礎,為深入解析光敏色素介導的光信號傳導網絡提供新的信息。
【學位單位】：煙臺大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S511
【文章目錄】：
摘要
Abstract
中英文符號說明
第一部分 文獻綜述
    1 CCCH鋅指蛋白
        1.1 CCCH鋅指蛋白的結構特征
        1.2 CCCH鋅指蛋白在植物生長中的功能
    2 光敏色素在植物生長發(fā)育中的作用
        2.1 光敏色素對幼苗去黃化的調控
        2.2 光敏色素對植物株型和育性的調控
        2.3 光敏色素對植物光周期現象的調控
        2.4 光敏色素參與調控植物對生物脅迫的抗性
        2.5 光敏色素參與調控植物對非生物脅迫的抗性及ABA代謝途徑
    3 PIFs在光敏色素介導的光信號傳導中的作用
    4 本論文的研究意義
    5 技術路線
第二部分 實驗論文
    第一章 通過生物信息學分析OsZFL1基因和OsZFL1蛋白
        1 材料與方法
        2 結果與分析
            2.1 OsZFL1基因的開放閱讀框
            2.2 OsZFL1蛋白序列的結構
            2.3 OsZFL1蛋白的系統(tǒng)進化樹分析
            2.4 OsZFL1啟動子區(qū)上游元件的預測
        3 討論
    第二章 OsZFL1基因的表達模式分析
        1 材料與方法
            1.1 實驗材料
            1.2 方法
        2 結果與分析
            2.1 OsZFL1基因在種子、葉和根的表達量分析
            2.2 光周期對OsZFL1基因表達的影響
        3 討論
    第三章 OsZFL1在水稻生長發(fā)育中的作用
        1 材料與方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2 結果與分析
            2.1 OsZFL1基因的克隆
            2.2 OsZFL1轉基因株系中OsZFL1基因的插入位點檢測及表達水平檢測
            2.3 OsZFL1基因可能影響水稻的ABA途徑
            2.4 OsZFL1基因參與調控GA信號途徑
            2.5 OsPIL-OX水稻中OsZFL1基因的表達水平的分析
            2.6 OsZFL1基因對OsPIL15過表達種子萌發(fā)的影響
            2.7 OsZFL1-CRISPR/Cas9植物表達載體的構建
            2.8 OsZFL1-OX株系和OsZFL1-CRISPR/Cas9株系的光敏感性分析
            2.9 OsZFL1株系對鹽脅迫和干旱脅迫的抗性分析調節(jié)
            2.10 OsZFL1基因調節(jié)水稻苗期的株高
            2.11 OsZFL1基因對水稻大田農藝性狀的影響
        3 討論
    第四章 水稻光敏色素B抗體的制備及其特異性檢測
第三部分 總結
論文的主要創(chuàng)新點
下一步的工作計劃
參考文獻
致謝
附錄

【參考文獻】

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本文編號：2840712