棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)是重要的農(nóng)業(yè)害蟲,近年來棉鈴蟲的防治問題引起廣泛的關(guān)注。本研究以棉鈴蟲體內(nèi)乙酰膽堿酯酶基因?yàn)閷ο?通過轉(zhuǎn)基因手段獲得表達(dá)Haace1基因的hp RNA植株,以探究其抗蟲價(jià)值。另外,構(gòu)建酵母hp RNA表達(dá)載體,與細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)(L4440/HT115)進(jìn)行的飼喂dsRNA RNAi實(shí)驗(yàn)進(jìn)行對比,探究酵母表達(dá)系統(tǒng)是否適合用于篩選RNAi靶標(biāo)基因。具體內(nèi)容如下:1.獲得轉(zhuǎn)Haace1基因煙草及遺傳分析將植物表達(dá)載體p RNAi-GG-ace1f、p RNAi-GG-ace1r轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404中,隨后農(nóng)桿菌菌液侵染煙草外植體,經(jīng)過植物組織培養(yǎng)技術(shù)獲得再生苗,卡那抗性篩選和PCR驗(yàn)證后,共獲得13株T0代Haace1f轉(zhuǎn)基因煙草和9株T0代Haace1r轉(zhuǎn)基因煙草;通過卡那抗性對T1代轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行抗性苗和白化苗的統(tǒng)計(jì),結(jié)果顯示:5株T0代Haace1f轉(zhuǎn)基因煙草中,有4株其后代卡那抗性遵循孟德爾3:1分離比,由此推測其為單拷貝插入,一株分離比為2.08:1,不符合孟德爾基因遺傳規(guī)律;5株Haace1r轉(zhuǎn)基因煙草,都符合孟德爾3:1的分離比,推測其都為單拷貝插入。2.轉(zhuǎn)基因煙草抗蟲性分析取新鮮的轉(zhuǎn)基因煙草葉片喂食棉鈴蟲二齡幼蟲,野生型葉片作對照,每隔一定時(shí)間觀察葉片咬噬情況和幼蟲生長狀況,RT-qPCR檢測幼蟲體內(nèi)Haace1基因表達(dá)情況。結(jié)果表明,Haace1f轉(zhuǎn)基因煙草和Haace1r轉(zhuǎn)基因煙草對幼蟲體內(nèi)Haace1基因表達(dá)均有抑制效果,并且Haace1r轉(zhuǎn)基因煙草的抑制效果更顯著。3.酵母和大腸桿菌dsRNA表達(dá)載體的Feeding-based RNAi分析酵母hp RNA表達(dá)載體的構(gòu)建是將植物表達(dá)載體p RNAi-GG-ace1f質(zhì)粒上的目的片段插入到p YES2質(zhì)粒上,并轉(zhuǎn)化到酵母INVSc1感受態(tài)中。酵母菌液飼喂棉鈴蟲,與大腸桿菌dsRNA表達(dá)載體的干涉效果進(jìn)行對比,RT-qPCR結(jié)果分析,表達(dá)dsRNA的酵母菌對目的基因的抑制效果不明顯,低于大腸桿菌的抑制效果。以上研究為以Haace1基因?yàn)榘袠?biāo)的植物基因工程和棉鈴蟲防治提供一些參考。
【學(xué)位單位】：河北大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S433;Q943.2
【部分圖文】：

第 1 章 文獻(xiàn)綜述第 1 章 文獻(xiàn)綜述1.1 乙酰膽堿酯酶研究進(jìn)展乙酰膽堿(Acetycholine，ACh)是一種神經(jīng)遞質(zhì)，存在于神經(jīng)細(xì)胞的小泡中由突觸前膜釋放，與突觸后膜上的受體結(jié)合；乙酰膽堿酯酶（AcetylcholinestraAChE）能夠在 ACh 發(fā)揮作用后水解其為膽堿和乙酸，使它喪失對突觸后膜的奮作用[1]，膽堿大部分能夠再次進(jìn)入突觸前膜，重新生成為乙酰膽堿分子。

圖 1.2 RNAi 的三種類型 （Lim，2016）Fig.1.2 Three types of RNAiAi 導(dǎo)入方法 實(shí)驗(yàn)中 dsRNA 進(jìn)入蟲體內(nèi)主要有三種方法：注射法最早在秀麗隱桿線蟲中使用顯微注射法注射 dsRNA組信息的公布，RNAi 技術(shù)運(yùn)用廣泛，這一技術(shù)已經(jīng)運(yùn)用，但是基因沉默效果參差不齊[43]。基于浸泡法因功能信息，適用于大規(guī)模的基因功能篩選，但 ds對于不易吸收 dsRNA 的昆蟲來說，基因沉默效率極用的范圍是有限的[44-45]。昆蟲中導(dǎo)入 dsRNA 的一種重要方法。1998 年，Tim表達(dá)的 dsRNA 對秀麗隱桿線蟲進(jìn)行基因沉默，此后泛應(yīng)用。目前主要有三種飼喂方法：第 1 種是直接喂

圖 1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)路線Fig.1.3 Experiment design本研究主要包括下面幾部分：1. 獲得 Haace1 轉(zhuǎn)基因煙草及遺傳分析：植物表達(dá)載體 pRNAi-GG-ace1f、pRNAi-GG-ace1r 轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài) LBA4404 中，農(nóng)桿菌菌液侵染無菌的煙草外植體，然后通過植物組織培養(yǎng)得到再生苗，即 T0代轉(zhuǎn) Haace1 基因煙草，卡那抗性篩選和 PCR 驗(yàn)證，并對結(jié)果均為陽性的 T0代煙草的種子進(jìn)行遺傳分析。2.轉(zhuǎn)基因煙草對棉鈴蟲的基因沉默效果：取新鮮的轉(zhuǎn)基因煙草葉片喂食棉鈴蟲二齡幼蟲，野生型葉片作對照，每隔一定時(shí)間觀察葉片咬噬情況和幼蟲生長狀況，RT-qPCR 檢測幼蟲體內(nèi) Haace1 基因表達(dá)情況。3. 酵母和大腸桿菌 dsRNA 表達(dá)載體的 Feeding-based RNAi 分析：大腸桿菌dsRNA 表達(dá)系統(tǒng)（L4440/HT115）由實(shí)驗(yàn)室提供，酵母 hpRNA 表達(dá)載體的構(gòu)建是通過設(shè)計(jì)合適的酶切位點(diǎn)，將 pRNAi-GG-ace1f 與 pYES2 質(zhì)粒酶切連接，構(gòu)成
【參考文獻(xiàn)】

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1 陳仲;廖維華;王靜澄;高凱;孫吉;安新民;;影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)的楊樹遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的因素[J];植物生理學(xué)報(bào);2014年08期

2 趙丹;趙德剛;李巖;;EuFPS基因表達(dá)載體構(gòu)建及對杜仲遺傳轉(zhuǎn)化的研究[J];基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué);2009年01期

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4 姜興印,王開運(yùn),儀美芹;棉鈴蟲人工飼料概述[J];昆蟲知識;2000年03期

本文編號：2838615