發(fā)布時間：2020-10-12 07:40

　　 菊花不僅是世界范圍重要的觀賞花卉,而且在醫(yī)藥、化工等方面具有重要的應(yīng)用價值,其已成為我國花卉產(chǎn)業(yè)中的支柱力量。菊花白色銹病是一種在世界范圍內(nèi)廣泛傳播的菊花病害,該病害不僅嚴(yán)重影響菊花的生長發(fā)育與生產(chǎn),而且極大的限制了菊花的推廣與應(yīng)用。目前,對于菊花白色銹病的研究主要集中于抗病品種的篩選,化學(xué)藥劑防治及病理研究等方面,而在分子生物學(xué)方面的研究較少,尤其是抗病相關(guān)基因的研究更少。在前期研究的基礎(chǔ)上,本研究克隆得到了與菊花抗白色銹病相關(guān)的基因CmDREBa-2,并進(jìn)行了表達(dá)分析與載體構(gòu)建,為進(jìn)一步了解菊花白色銹病的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ),也為培養(yǎng)抗病新品種提供了候選基因。1.根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),利用RACE和RT-PCR技術(shù)克隆得到一個DREB類基因。該基因cDNA全長834bp,基因的開放閱讀框有291 bp,編碼96個氨基酸;氨基酸序列分析表明,該基因含有1個AP2結(jié)構(gòu)域,并且結(jié)構(gòu)域中第十四位氨基酸為DREB家族標(biāo)志的纈氨酸(V),氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)該蛋白的AP2結(jié)構(gòu)域與已公布的CmDREBa蛋白一樣,第十九位都為組氨酸(H),而不是大部分DREB蛋白含有谷氨酸(E),且氨基酸進(jìn)化樹分析表明該蛋白與CmDREBa蛋白同源關(guān)系最近,因此將此基因命名為CmDREBa-2。并用ProtParam對該基因編碼的蛋白進(jìn)行了理化性質(zhì)分析,結(jié)果表明,該蛋白相對分子質(zhì)量為11159.04,理論等電點11.34,氨基酸序列中精氨酸(Arg)的使用率最高,占14.6%,蛋白分子式為C_(491)H_(806)N_(160)O_(130)S_4;該蛋白,為不穩(wěn)定、親水性蛋白;亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示,該蛋白于細(xì)胞核中發(fā)揮作用。2.采用實時熒光定量分析了CmDREBa-2基因的表達(dá)模式,白色銹病病原菌處理后該基因在葉子中的表達(dá)量最高,和白色銹病危害菊花的部位相同;在菊花白色銹病誘導(dǎo)下,CmDREBa-2基因在高抗品種‘C029’中的表達(dá)量出現(xiàn)明顯變化,在6h達(dá)到峰值,并且整體表達(dá)量高于對照組;激素處理結(jié)果表明,CmDREBa-2基因能夠響應(yīng)乙烯利(ETH)、水楊酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)的誘導(dǎo),說明該基因通過多種途徑參與菊花抵御白色銹病的調(diào)節(jié);非生物脅迫處理表明,CmDREBa-2基因受干旱,鹽,高溫和低溫的誘導(dǎo),但對干旱最不敏感,對高溫最為敏感。3.我們構(gòu)建了以pBI-121為基礎(chǔ)表達(dá)載體的CmDREBa-2基因超表達(dá)載體pBI-121-CmDREBa-2,通過菌液PCR和雙酶切驗證了載體的正確性,并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài),為下一步轉(zhuǎn)化植株奠定基礎(chǔ);還構(gòu)建了以AP2結(jié)構(gòu)域上游175bp片段為干擾片段,pTRV1和pTRV2為載體的沉默表達(dá)載體,同樣驗證其正確性后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌備用。
【學(xué)位單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S436.8
【部分圖文】：

性有重要的作用。但是研究發(fā)現(xiàn)在不含有 ABA 應(yīng)答受體的擬南、低溫和高鹽等脅迫誘導(dǎo)下也能表達(dá)，已發(fā)現(xiàn)的該類基因包括 rd47 等（Shinozaki et al.，2000）。DREB 轉(zhuǎn)錄因子能與順勢作用元件而激活脅迫應(yīng)答基因。最初的研究表明 DRE/CRT 元件含有 ABA號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，但后來研究發(fā)現(xiàn) cor78a、rd29A 啟動子的 DRE/CRT 應(yīng)答元件，但是受 DREB 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的基因中含有 DRE/CRT明 DREB 轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控抗逆基因時存在非依賴 ABA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)極大增強(qiáng)了植物對逆境脅迫的耐受性。在的研究成果顯示，大部分已發(fā)現(xiàn)的 DREB 轉(zhuǎn)錄因子均能 DRE性結(jié)合（高世慶 等，2005）。有的 DREB 轉(zhuǎn)錄因子（A-1 和 A途徑中不用 ABA；有的則需要通過 ABA 途徑實現(xiàn)對抗逆基因的T 順勢作用元件在參與脅迫應(yīng)答過程中，存在著依賴 ABA 信號轉(zhuǎn) 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，兩者之間通過一些具有相同組分的物質(zhì)緊密的聯(lián)內(nèi)形成一個復(fù)雜而完備的逆境脅迫應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)，使得植物的逆境脅 等，2017）（圖 1-1）。

第一章 前言 CmYB8 基因發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株比野生型植株的花期大為延遲，沉默該基為提前，并且在沉默 CmYB8 基因株系中，超表達(dá) cmo-MIR156 基因發(fā)現(xiàn)得正常，從而確定該 CmYB8 基因通過調(diào)控 cmo-MIR156 基因調(diào)控花期。究目的與意義是我國傳統(tǒng)名花，在我國花卉產(chǎn)業(yè)中占據(jù)重要位置。菊花白色銹病給菊花造成重大影響，培育抗白色銹病品種是菊花產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要一步。本菊花 DREB 轉(zhuǎn)錄因子基因，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析、表達(dá)模式分析和研究其在菊花抵御白色銹病過程中如何調(diào)控抗逆基因提供理論基礎(chǔ)，對菊分子抗病機(jī)制有更深入的認(rèn)識，并且為進(jìn)一步通過功能驗證尋找到能用于病基因打下基礎(chǔ)。

轉(zhuǎn)錄組序列驗證引物e transcriptome sequence primersB055-FB055-RATGTTGGCTTCACAAACCCGAGGACTGCGGGATAGG5′ RACE 特異性引物ene specific primers for 5′ RACEGSP1GSP2GSP3CAGCGGTGTCATGTGTACTTCCTACTCCTTACACCTGGGTGTCGTGTCTCCTTG3′ RACE 特異性引物ene specific primers for 3′ RACEC038-1C038-2ACACATGACACCGCTGACATGGCAATGAGAGGTCGATCCGCGTGTTTA特異擴(kuò)增引物ecificamplification primerCmDREBa-2-FCmDREBa-2-RATGCATATCGAATCACAATACCTTCTAAAAACACCTCAACGACATGTC結(jié)果與分析 菊花總 RNA 提取質(zhì)量對所提取的菊花總 RNA，進(jìn)行 10%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖 2-1 所示，明確清晰分別為 18 S 和 28 S，28 S 亮度約為 18 S 的 2 倍，并且經(jīng)測定 OD260/OD在 2.0 左右說明 RNA 提取質(zhì)量較好，可以用于下一步的試驗。
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 熊超明;趙興華;賈紅梅;延昕;毛洪玉;;菊花抗白色銹病相關(guān)基因CmDREBa-2的克隆及表達(dá)分析[J];園藝學(xué)報;2018年05期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 熊超明;菊花抗白色銹病相關(guān)基因CmDREBa-2的克隆及表達(dá)分析[D];沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

2 李娜（Lee Na）;菊花CmDREBa-2基因的同源轉(zhuǎn)化及功能驗證[D];沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

本文編號：2837852