免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig),又常被稱為抗體,是機體抵御外界病原微生物入侵最重要的免疫分子之一。經(jīng)典的免疫球蛋白由兩條重鏈和兩條輕鏈共同組成,僅由重鏈構(gòu)成而不結(jié)合輕鏈的免疫球蛋白被稱為重鏈抗體(Heavy chain only antibody)。重鏈抗體在正常情況下被認為是不正常的抗體類型,而在駝科動物及一些魚類如鯊魚、銀鮫中,卻天然存在重鏈抗體類型。駝科動物中的重鏈抗體相比較于經(jīng)典抗體,具有明顯的結(jié)構(gòu)特點和在抗原結(jié)合方面的優(yōu)勢,所以近年來在實驗室研究、試劑診斷和抗體藥物研發(fā)等多個領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。目前幾乎所有重鏈抗體都來源于駝科動物,但駝科動物的飼養(yǎng)和免疫操作在很大程度上限制了重鏈抗體的廣泛應(yīng)用�；诖嗽�,我們試圖利用遺傳修飾小鼠來表達重鏈抗體。由于天然重鏈抗體都缺乏重鏈恒定區(qū)第一個結(jié)構(gòu)域(CH1結(jié)構(gòu)域),本論文通過刪除小鼠中表達量最高的IgG1型抗體編碼基因γ1的CH1外顯子,在不修飾小鼠抗體可變區(qū)的情況下,研究小鼠是否能表達有功能的IgG1型重鏈抗體,為重鏈抗體的獲得和應(yīng)用提供新的思路和方法。本研究首先通過構(gòu)建基因打靶載體,在小鼠ES細胞中,以neo基因定點替換掉了小鼠內(nèi)源的γ 1-CH1外顯子。通過PCR和Southern Blot的方法對于ES細胞基因型進行了鑒定,將打靶成功的小鼠ES細胞顯微注射到小鼠囊胚中,得到以neo基因替換小鼠γ 1-CH1外顯子的129Sv/JNeo+/Neo+小鼠品系。隨后的研究發(fā)現(xiàn)該品系小鼠并不能正常表達分泌型的IgG1型抗體。因此通過Cre-loxP系統(tǒng),對于外源neo基因進行了刪除,得到了刪除內(nèi)源γ 1-CH1外顯子而并不攜帶neo基因的HG1小鼠品系。進一步通過PCR和Southern Blot的方法對于HG1小鼠基因型進行了確證。通過RT-PCR的方法,對于HG1小鼠中γ1基因轉(zhuǎn)錄進行檢測,發(fā)現(xiàn)其可以正常轉(zhuǎn)錄。隨后的q-PCR實驗表明γ1基因在HG1小鼠中轉(zhuǎn)錄水平較低,約為野生型小鼠中γ1基因轉(zhuǎn)錄水平的1/4。Western Blot實驗檢測到HG1小鼠血清中存在分泌型IgG1型抗體,通過特異性結(jié)合輕鏈的Protein L磁珠處理血清,證實了在HG1小鼠血清中的IgG1型抗體為預(yù)期的重鏈抗體類型。通過對小鼠脾臟和骨髓中B細胞流式分析檢測發(fā)現(xiàn),HG1小鼠骨髓中祖B細胞所占相對比例為32.91 ±3.54%,比野生型小鼠中顯著提高(22.28± 1.76%,p0.05);前B細胞所占相對比例為66.33 ±3.71%,比野生型小鼠中顯著降低(77.24 ± 1.8%,p0.05);未成熟B細胞和成熟B細胞在HG1小鼠中和野生型小鼠中所占比例類似,統(tǒng)計學(xué)意義上沒有顯著的差異。脾臟中漿細胞所占比例在HG1小鼠中極顯著提高(p0.0001)。但是表達IgG1型抗體的漿細胞比例在HG1小鼠中顯著降低(p0.001)。對于HG1小鼠中重鏈抗體的可變區(qū)序列分析發(fā)現(xiàn),重鏈抗體偏好使用一些可變區(qū)家族如IGHV1家族,同時重鏈抗體結(jié)合抗原的關(guān)鍵區(qū)域CDR3也傾向于使用更長的氨基酸長度。ELISA測定小鼠血清中各種免疫球蛋白種類和亞型的含量發(fā)現(xiàn),相比較于野生型小鼠,IgG1型重鏈抗體在HG1小鼠中表達量顯著降低,約為野生型小鼠中IgG1型抗體表達量的1/3(p0.01)。其它免疫球蛋白種類和亞型表達水平呈現(xiàn)出不同程度的升高。通過抗原OVA的免疫實驗,發(fā)現(xiàn)HG1小鼠中IgG1型重鏈抗體能夠產(chǎn)生免疫反應(yīng),產(chǎn)生抗原特異性的IgG1型重鏈抗體。但是相比較野生型小鼠來看,HG1小鼠中免疫后抗原特異性重鏈抗體滴度較低,僅為200,928.3 U/mL,而野生型小鼠中這一數(shù)據(jù)高達3,212,742 U/mL,也說明HG1小鼠中重鏈抗體的免疫應(yīng)答能力較弱。隨后利用OVA抗原免疫后的HG1小鼠建立了重鏈抗體可變區(qū)的噬菌體文庫,通過親和篩選得到了 12條特異性的重鏈抗體可變區(qū)序列。以結(jié)合抗原的關(guān)鍵區(qū)域CDR3氨基酸序列作為篩選依據(jù),選取其中5條序列進行了原核表達得到5株納米抗體,分別為8#,10#,18#,35#,42#。對于這5株納米抗體,通過ELISA實驗檢測了其對于抗原OVA的結(jié)合能力,發(fā)現(xiàn)只有10#和35#呈現(xiàn)出一定程度的抗原結(jié)合能力,其中10#結(jié)合能力最強。隨后以生物膜層干涉技術(shù),對于10#納米抗體和抗原OVA的解離曲線進行測定,發(fā)現(xiàn)10#納米抗體可以較好的結(jié)合抗原OVA純品,但相比較于商品化抗體標(biāo)準(zhǔn),其特異性和親和力仍存在差距。綜上所述,我以小鼠為研究對象,通過刪除小鼠內(nèi)源γ1-CH1外顯子,得到了穩(wěn)定表達IgG1型重鏈抗體的HG1小鼠品系。通過對于HG1小鼠品系的研究,發(fā)現(xiàn)其表達的IgG1型重鏈抗體能夠產(chǎn)生較弱的免疫反應(yīng)。隨后通過噬菌體展示技術(shù),從HG1小鼠中得到了特異性識別抗原OVA的納米抗體。但與常規(guī)單克隆抗體相比,這些納米抗體表現(xiàn)出較弱的抗原特異性和親和力。本研究證實了利用遺傳修飾小鼠表達有功能重鏈抗體的可能性,為重鏈抗體的來源及應(yīng)用提供了一條新的思路和方法。
【學(xué)位單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：Q939.91
【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略詞表
第一章 文獻綜述
    1.1 免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)和功能
        1.1.1 免疫球蛋白分子結(jié)構(gòu)
        1.1.2 免疫球蛋白類型和基本功能
        1.1.3 免疫球蛋白基因組成和重鏈基因座位
    1.2 免疫球蛋白多樣性產(chǎn)生機制
        1.2.1 V（D）J重組
        1.2.2 體細胞超突變
        1.2.3 基因轉(zhuǎn)換
        1.2.4 類別轉(zhuǎn)換重組
    1.3 B細胞發(fā)育及抗體的形成
    1.4 重鏈抗體
        1.4.1 重鏈抗體的發(fā)現(xiàn)
        1.4.2 駝科動物重鏈抗體序列和結(jié)構(gòu)特點
        1.4.3 駝科動物重鏈抗體形成原因
        1.4.4 駝科動物重鏈抗體的優(yōu)勢和應(yīng)用
    1.5 非天然重鏈抗體的研究進展
    1.6 抗體的篩選和制備
    1.7 研究目的和意義
第二章 材料與方法
    2.1 技術(shù)路線
    2.2 實驗材料
        2.2.1 菌株、載體及細胞
        2.2.2 實驗動物
        2.2.3 常用實驗試劑
        2.2.4 實驗用試劑盒
        2.2.5 常用試劑配制方法
    2.3 實驗儀器設(shè)備
    2.4 實驗方法
        2.4.1 DNA的提取
        2.4.2 RNA的提取
        2.4.3 PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件
        2.4.4 反轉(zhuǎn)錄
        2.4.5 定量PCR
        2.4.6 5' RACE
        2.4.7 感受態(tài)細胞制備與效價測定
        2.4.8 克隆轉(zhuǎn)化
        2.4.9 Western Blot
        2.4.10 Southern Blot
        2.4.11 流式細胞術(shù)
        2.4.12 Protein L純化血清
        2.4.13 噬菌體文庫的構(gòu)建
        2.4.14 噬菌體文庫親和篩選
        2.4.15 抗體的原核表達和純化
        2.4.16 小鼠免疫
        2.4.17 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）
        2.4.18 斑點雜交
        2.4.19 統(tǒng)計分析
    2.5 生物信息分析軟件及常用網(wǎng)站
第三章 結(jié)果與分析
    3.1 IgG1型重鏈抗體表達小鼠的構(gòu)建
Neo+/Neo+小鼠構(gòu)建'>        3.1.1 129Sv/J^Neo+/Neo+小鼠構(gòu)建
Neo+/Neo+小鼠重鏈抗體表達的檢測'>        3.1.2 129Sv/J^Neo+/Neo+小鼠重鏈抗體表達的檢測
        3.1.3 HG1小鼠的建立
        3.1.4 IgG1型重鏈抗體的檢測
        3.1.5 小結(jié)
    3.2 HG1小鼠血清中免疫球蛋白表達水平的檢測
    3.3 HG1小鼠B細胞發(fā)育的研究
        3.3.1 HG1小鼠骨髓中B細胞發(fā)育的研究
        3.3.2 HG1小鼠脾臟中B細胞發(fā)育的研究
        3.3.3 HG1小鼠脾臟中漿細胞研究
        3.3.4 小結(jié)
    3.4 HG1小鼠可變區(qū)特點的研究
        3.4.1 HG1小鼠VH、DH和JH家族使用特點研究
        3.4.2 HG1小鼠抗體可變區(qū)CDR3長度特點研究
        3.4.3 序列保守性研究
        3.4.4 小結(jié)
    3.5 HG1小鼠免疫應(yīng)答特點的研究
    3.6 HG1小鼠抗原特異性重鏈抗體或納米抗體篩選
        3.6.1 HG1小鼠可變區(qū)免疫文庫構(gòu)建
        3.6.2 噬菌體文庫的篩選
        3.6.3 噬菌體抗原特異性檢測
        3.6.4 小結(jié)
    3.7 HG1小鼠來源納米抗體表達和親和力初步檢測
        3.7.1 原核表達載體的構(gòu)建
        3.7.2 納米抗體表達檢測
        3.7.3 納米抗體抗原特異性檢測
        3.7.4 小結(jié)
    3.8 HG1小鼠來源納米抗體的純化和親和力驗證
        3.8.1 納米抗體的純化
        3.8.2 純化納米抗體抗原特異性ELISA檢測
        3.8.3 純化納米抗體抗原特異性斑點雜交檢測
        3.8.4 納米抗體抗原特異性的BLI檢測
        3.8.5 小結(jié)
第四章 討論與展望
第五章 結(jié)論
參考文獻
附錄
致謝
個人簡歷


本文編號：2836878