產(chǎn)腸毒素大腸桿菌F18(E.coli F18)是引起斷奶仔豬腹瀉的主要病原菌,是目前規(guī)模養(yǎng)豬生產(chǎn)中的重要威脅因素。從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看,深入研究斷奶仔豬對(duì)大腸桿菌抗性的分子機(jī)制,進(jìn)行抗病育種,才是消除該病的治本辦法。殺菌通透性增強(qiáng)蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein, BPI)屬于抗菌類蛋白,在動(dòng)物機(jī)體天然防御中起到了很重要的作用。它不僅可以殺滅革蘭氏陰性菌(gram-negative bacterial, GNB),還具有中和內(nèi)毒素或脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)的活性、調(diào)理和促進(jìn)補(bǔ)體活化和抑制血管生成等一系列生物學(xué)功能,而F18大腸桿菌作為革蘭氏陰性菌,其細(xì)胞壁的主要成分脂多糖LPS(又稱為內(nèi)毒素)也是細(xì)菌主要的致病因子。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),BPI基因在培育品種蘇太豬斷奶仔豬腸道中具有明顯的組織特異性和發(fā)育性表達(dá)規(guī)律,而且在十二指腸和空腸中的高表達(dá)對(duì)抗斷奶仔豬腸道中E.coli F18的感染可能具有直接作用。1.本研究以中國(guó)地方豬品種梅山豬為試驗(yàn)材料,分析BPI基因在梅山斷奶仔豬中的組織表達(dá)譜,同時(shí)分析BPI基因在梅山仔豬從初生到斷奶不同發(fā)育時(shí)期以及E.coli F18抗性型/易感型個(gè)體之間的表達(dá)差異,進(jìn)一步分析驗(yàn)證BPI基因的表達(dá)規(guī)律及其對(duì)E.coli F18抗性的作用。Real-time PCR檢測(cè)梅山豬個(gè)體心、肝、脾、肺、腎、胃、肌肉、胸腺、淋巴、十二指腸和空腸等11個(gè)組織中BPI基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明,BPI基因僅在梅山斷奶仔豬腸道組織中高度表達(dá)；分析BPI基因在梅山仔豬從初生到斷奶5個(gè)不同發(fā)育時(shí)期(7日齡、14日齡、21日齡、28日齡和35日齡)十二指腸及空腸組織中表達(dá)水平,結(jié)果表明,總體上在十二指腸和空腸中BPI基因表達(dá)水平隨日齡的增加呈升高趨勢(shì)。其中,在斷奶后的35日齡,BPI基因在十二指腸中的表達(dá)水平極顯著高于7日齡(P0.01);28及35日齡BPI在空腸組織中的mRNA表達(dá)水平極顯著高于7、14和21日齡個(gè)體中的表達(dá)水平(P0.01)；進(jìn)一步比較分析梅山斷奶仔豬E coli F18抗性型/易感型個(gè)體腸道組織中BPI基因的差異表達(dá),結(jié)果表明,BPI基因在抗性型仔豬十二指腸中的表達(dá)量極顯著高于易感型個(gè)體(P0.01)。本試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí),BPI基因在梅山豬仔豬腸道組織中的表達(dá)同樣呈現(xiàn)明顯的組織特異性和發(fā)育性表達(dá)規(guī)律,而且BPI基因的表達(dá)上調(diào)也有利于提高梅山豬斷奶仔豬對(duì)F18大腸桿菌的抗性。2.運(yùn)用BSP(Bisulfite Sequencing PCR)測(cè)序法檢測(cè)梅山豬及蘇太豬斷奶仔豬十二指腸組織中BPI基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平,分析重要甲基化位點(diǎn)對(duì)BPI基因mRNA表達(dá)水平影響和調(diào)控作用。生物信息學(xué)分析表明,豬BPI基因外顯子1及上游5000bp區(qū)域存在一個(gè)CpG島,共包含10個(gè)CpG位點(diǎn)。BSP測(cè)序結(jié)果表明,蘇太豬BPI基因啟動(dòng)子區(qū)10個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化程度普遍高于梅山豬個(gè)體,甲基化水平與表達(dá)量相關(guān)性分析表明,BPI基因CpG島整體的甲基化程度與mRNA表達(dá)之間呈一定負(fù)相關(guān)性(r=-0.686r0.05=0.811),其中CpG-3、CpG-7、CpG-9位點(diǎn)呈顯著負(fù)相關(guān)(P0.05),CpG-2呈極顯著負(fù)相關(guān)(P0.01)。說(shuō)明該區(qū)域CpG-2、CpG-3、CpG-7、CpG-9等重要的甲基化位點(diǎn)可能抑制了基因的表達(dá),今后有望通過(guò)對(duì)這些位點(diǎn)的去甲基化提高BPI的表達(dá)水平,從而提高腸道組織對(duì)于革蘭氏陰性菌的抵抗能力。3.采用BSP(Bisulfite Sequencing PCR)+Miseq測(cè)序的方法,以課題組前期建立的蘇太斷奶仔豬E coli F18抗性型/易感型個(gè)體的腸道組織為檢測(cè)對(duì)象,分析重要甲基化位點(diǎn)對(duì)BPI基因mRNA表達(dá)水平的影響和調(diào)控作用,探討B(tài)PI基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平在仔豬抵抗E coil F18感染過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制,BSP+Miseq檢測(cè)結(jié)果表明,mC-3、mC-14和mC-15等位點(diǎn)的甲基化水平在抗性型/易感型個(gè)體的腸道組織中存在很大的差異；E. coliF18抗性型/易感型個(gè)體在腸道組織中BPI基因整體甲基化水平與表達(dá)量呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.611,r005=0.497),mC-7位點(diǎn)呈極顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.64l,r0.01=0.623),mC-15位點(diǎn)存在顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.564)。在一定程度上說(shuō)明,E. coli F18抗性型/易感型個(gè)體的表達(dá)差異與BPI基因部分位點(diǎn)的甲基化有關(guān),mC-15位點(diǎn)的甲基化可能在E coli F18抗性的過(guò)程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。4.采用BSP(Bisulfite Sequencing PCR)+Miseq測(cè)序的方法,檢測(cè)蘇太斷奶仔豬11個(gè)不同組織BPI基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平,探討B(tài)PI基因的組織特異性表達(dá)是否與甲基化修飾有關(guān)。對(duì)甲基化擴(kuò)增片段分析發(fā)現(xiàn),該片段共包含了15個(gè)CG位點(diǎn),且都發(fā)生了不同程度的甲基化,除此之外,mC-8和mC-10的CAC位點(diǎn),15號(hào)的CAA位點(diǎn)也發(fā)生了甲基化；蘇太斷奶仔豬11個(gè)不同組織中BPI基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平不同,結(jié)合mRNA表達(dá)水平分析發(fā)現(xiàn),不同組織BPI基因整體的甲基化與表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.41,r0os=0.34)。其中mC-15位點(diǎn)與基因表達(dá)存在顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.42,r0.05=0.34),對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行生物信息學(xué)分析,有12個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分布在擴(kuò)增片段上,其中第3、4、5、15甲基化位點(diǎn)位于Sp1和C/EBPp轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)上。結(jié)合EMSA試驗(yàn)驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)mC-15位點(diǎn)甲基化位點(diǎn)在一定程度上抑制了Sp1和C/EBPP轉(zhuǎn)錄因子與BPI基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合,進(jìn)而影響基因在不同組織中的表達(dá)水平。
【學(xué)位單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：S828
【部分圖文】：

擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，具體程序?yàn)椋海?‘Ｃ?１５?Ｓ，６０?‘Ｃ?１?ｍｉｎ；果分析??ｔ方法對(duì)相對(duì)定量的結(jié)果進(jìn)行處理［５８］。２－ａ心法計(jì)算公式；ＡＡＣｔ值一待測(cè)沮看家基因Ｃｔ值的幾何平均數(shù)）一（對(duì)照組目家基因Ｃｔ值的幾何平均數(shù)），即每一個(gè)樣本目標(biāo)基因表達(dá)經(jīng)內(nèi)某個(gè)樣本的倍數(shù)。其中，Ｃｔ?（初始循環(huán)數(shù)）作為Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ?ｌｉｎ值，即ＰＣ民擴(kuò)增過(guò)程中產(chǎn)生的焚光信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到目標(biāo)闊值所對(duì)公／Ｖ基因在不同組織中的表達(dá)進(jìn)行差異分析。??的提取結(jié)果??仔豬各組織總ＲＮＡ的提取質(zhì)量，結(jié)果如圖所示，總ＲＮＡ的拖尾現(xiàn)象，說(shuō)明提取的總ＲＮＡ可用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。??

相對(duì)巧光定量ＰＣ民檢測(cè)公Ｐ／及戶公／／基因表達(dá)特異性，烙解曲線只有一個(gè)特異性??峰，表明公尸／和因引物在擴(kuò)增中沒(méi)有引物二聚體或非特異性產(chǎn)物，可用于進(jìn)－－??步試驗(yàn)分析。其中公Ｐ／及Ｇ心Ｗ／／基因烙解曲線見(jiàn)圖２．２。??理島??ＭＸ?ｉＭ?Ｋｆｔ?？■?？？?俳《?—■?Ｋｔ?ｎ？?ｍ？?？？?—？?？ｕ??Ｔ？？ｉ｛Ｍｉｒａｔｕｗ?）??圖２．２?３／７和６＾戶￡）片堪因的溶解曲線??Ｆｉｇｕｒｅ２．２?Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｃｕｒｖｅ?ａｎｄ?ｍｅｌｔｉｎｇ?ｃｕｒｖｅ?ｏｆ?ＢＰＩ?ａｎｄ?ＧＡＰＤＨ?ｇｅｎｅ??３．３梅山豬公尸／基因的組織表達(dá)譜分析??本試驗(yàn)采用實(shí)時(shí)巧光定量ＰＣＲ方法，檢測(cè)梅山豬斷奶仔豬個(gè)體１１個(gè)組織中公尸／基因表??達(dá)水平。結(jié)果如圖２．３：?５／Ｖ基因在十二指腸及空腸中高度表達(dá)，而在其它沮織中表達(dá)普遍??較低（圖２．３）。??Ｓ?６００－１??．累?４００－?Ｔ??心６０下?圓圓Ｉ?■ｍ??＾４０－?國(guó)圓??１?４?，Ｔ?國(guó)國(guó)??Ｕ?—廣＇?１，１?Ｉ?Ｉ?Ｉ?Ｉ?Ｉ?Ｉ?Ｉ??圖２．３公戶／基因在梅山豬不同組織中的表達(dá)情況??Ｆｉｇｕｒｅ２．３?Ｔｈｅ?ｅｘｐｒｅ巧ｉｏｎ?ｏｆ?公戶／ｇｅｎｅ?ｉｎ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｔｉｓｓｕｅｓ?ｏｆ?Ｍｅｉｓｈａｎ?ｐｉｇｌｅｔｓ??３．４公ｉＶ基因在梅山豬不同發(fā)育時(shí)期十二指腸和空腸組織的差異表達(dá)??比較５個(gè)不同發(fā)育時(shí)期公Ｐ／在十二指腸及空腸組織中的表達(dá)規(guī)律

相對(duì)巧光定量ＰＣ民檢測(cè)公Ｐ／及戶公／／基因表達(dá)特異性，烙解曲線只有一個(gè)特異性??峰，表明公尸／和因引物在擴(kuò)增中沒(méi)有引物二聚體或非特異性產(chǎn)物，可用于進(jìn)－－??步試驗(yàn)分析。其中公Ｐ／及Ｇ心Ｗ／／基因烙解曲線見(jiàn)圖２．２。??理島??ＭＸ?ｉＭ?Ｋｆｔ?？■?？？?俳《?—■?Ｋｔ?ｎ？?ｍ？?？？?—？?？ｕ??Ｔ？？ｉ｛Ｍｉｒａｔｕｗ?）??圖２．２?３／７和６＾戶￡）片堪因的溶解曲線??Ｆｉｇｕｒｅ２．２?Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｃｕｒｖｅ?ａｎｄ?ｍｅｌｔｉｎｇ?ｃｕｒｖｅ?ｏｆ?ＢＰＩ?ａｎｄ?ＧＡＰＤＨ?ｇｅｎｅ??３．３梅山豬公尸／基因的組織表達(dá)譜分析??本試驗(yàn)采用實(shí)時(shí)巧光定量ＰＣＲ方法，檢測(cè)梅山豬斷奶仔豬個(gè)體１１個(gè)組織中公尸／基因表??達(dá)水平。結(jié)果如圖２．３：?５／Ｖ基因在十二指腸及空腸中高度表達(dá)，而在其它沮織中表達(dá)普遍??較低（圖２．３）。??Ｓ?６００－１??．累?４００－?Ｔ??心６０下?圓圓Ｉ?■ｍ??＾４０－?國(guó)圓??１?４?，Ｔ?國(guó)國(guó)??Ｕ?—廣＇?１，１?Ｉ?Ｉ?Ｉ?Ｉ?Ｉ?Ｉ?Ｉ??圖２．３公戶／基因在梅山豬不同組織中的表達(dá)情況??Ｆｉｇｕｒｅ２．３?Ｔｈｅ?ｅｘｐｒｅ巧ｉｏｎ?ｏｆ?公戶／ｇｅｎｅ?ｉｎ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｔｉｓｓｕｅｓ?ｏｆ?Ｍｅｉｓｈａｎ?ｐｉｇｌｅｔｓ??３．４公ｉＶ基因在梅山豬不同發(fā)育時(shí)期十二指腸和空腸組織的差異表達(dá)??比較５個(gè)不同發(fā)育時(shí)期公Ｐ／在十二指腸及空腸組織中的表達(dá)規(guī)律
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2 朱璟;BPI基因?qū)嗄套胸iF18大腸桿菌抗性的功能分析[D];揚(yáng)州大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2836670