馬鈴薯是全球第四大重要糧食作物,其營養(yǎng)豐富、種植廣泛,作為糧菜兩用的作物深受市場歡迎。馬鈴薯生長發(fā)育過程中易受高鹽、干旱等非生物脅迫影響,嚴重影響其產(chǎn)量與品質(zhì)。因此發(fā)掘馬鈴薯抗逆相關(guān)基因并對其功能進行深入研究具有重要意義。半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cysteine protease inhibitor,CPI)在植物體內(nèi)分布廣泛,其參與植物體對環(huán)境脅迫的應(yīng)答、細胞程序化死亡(programmed cell death,PCD)、植物體新陳代謝調(diào)節(jié)等。本研究從商用四倍體栽培品種“荷蘭15號”中克隆得到一個馬鈴薯CPI基因StCPI,對其蛋白序列進行生物信息學分析并在大腸桿菌BL21(DE3)中原核表達StCPI蛋白。在高鹽和干旱脅迫下驗證StCPI基因在大腸桿菌的功能后構(gòu)建植物表達載體PBI121-StCPI,并用二倍體過表達馬鈴薯植株,探討StCPI在抗鹽和抗旱中的作用。主要研究成果如下:1.克隆了一個馬鈴薯基因StCPI,該基因開放閱讀框(open reading frame,ORF)全長為666 bp,編碼221個氨基酸。分析工具Ex PASy ProtParam tool預測其編碼蛋白分子式為C_(1123)H_(1770)N_(290)O_(324)S_8、分子量24.7 KD、等電點為6.88、脂肪指數(shù)為101.26、不穩(wěn)定指數(shù)為25.32、平均疏水性為0.006,推測StCPI為穩(wěn)定親水蛋白。SignalP信號肽分析其N端含有23個氨基酸的信號肽,TMHMM預測跨膜區(qū)氨基酸為9.1363個,說明StCPI不具有跨膜結(jié)構(gòu)域,不是膜上的受體或者定位于膜上。2.構(gòu)建了pET28-StCPI原核表達重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中誘導表達并通過Western Blot驗證。融合蛋白以包涵體形式表達,將帶有組氨酸(His)標簽的融合蛋白通過Ni柱親和層析純化,透析復性后獲得StCPI能顯著抑制木瓜蛋白酶活性,結(jié)果表明大腸桿菌表達的StCPI體外具有CPI活性。3.過表達StCPI基因能夠提升大腸桿菌的抗鹽脅迫和抗干旱脅迫能力。通過0.25M、0.5 M、0.75 M、1 M的NaCl和15%、20%、25%、30%PEG8000平板的斑點生長實驗及對0.5 M NaCl脅迫下的生長曲線測定,結(jié)果表明,與轉(zhuǎn)pET28空載體的大腸桿菌相比,轉(zhuǎn)pET28-StCPI質(zhì)粒的大腸桿菌在0.5 M的NaCl高鹽脅迫和30%濃度的PEG干旱脅迫條件下能夠正常生長,結(jié)果表明,轉(zhuǎn)pET28-StCPI質(zhì)粒的大腸桿菌能夠耐受0.5M的NaCl高鹽脅迫,而轉(zhuǎn)空pET28載體的大腸桿菌完全不能生長,前者在高鹽脅迫和干旱脅迫下生長情況顯著優(yōu)于后者。4.過表達StCPI基因能夠提升馬鈴薯試管苗的抗鹽脅迫和抗干旱脅迫能力。選取表達量最高的OE3二倍體StCPI過表達馬鈴薯苗進行NaCl和干旱脅迫實驗,結(jié)果表明0.2%NaCl脅迫處理3 d后野生型植株大部分死亡,表現(xiàn)為植株葉片的萎縮卷曲導致植株的萎蔫;超表達StCPI株系植株均能正常存活生長,但受鹽脅迫影響部分葉片頂部和邊緣位置出現(xiàn)枯黃。連續(xù)10 d干旱脅迫后,轉(zhuǎn)基因植株生長情況顯著好于野生型。上述實驗結(jié)果表明StCPI在二倍體馬鈴薯植株體內(nèi)的過表達能夠增強植株對高鹽脅迫和干旱脅迫的抗性。
【學位單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S532;Q943.2
【部分圖文】：

馬鈴薯塊莖總RNA電泳結(jié)果

StCPI基因片段擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果

山東農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文以馬鈴薯（荷蘭 15 號）塊莖總 RNA 反轉(zhuǎn)錄獲得的 cDNA 為模板，以 StCPI-F、StC引物，使用 PCR 方法擴增得到 StCPI 基因的 ORF 全長序列。電泳檢測如圖 2 所增得到一條 666 bp 的 DNA 條帶，擴增量較大，特異性強，片段大小與預測結(jié)果一陰性對照未出現(xiàn)條帶，說明目的基因被成功克隆出，將該基因命名為 StCPI。.3 測序結(jié)果比對將 PCR 產(chǎn)物純化后回收，委托北京華大基因研究公司檢測。堿基序列如圖 3 所測序獲得序列使用 DNAMAN 與 NCBI 上的馬鈴薯 CPI 基因序列（XM_0063538對，結(jié)果表明二者同源性為 100%，表明 StCPI 基因被成功克隆出。
【參考文獻】

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本文編號：2836385