干旱是限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一個重要的環(huán)境因素,全球干旱、半干旱地區(qū)約占土地總面積的36%,占耕地面積的43%。我國干旱、半干旱地區(qū)面積約占全國土地面積的二分之一,主要分布于西北地區(qū)。小麥是主要糧食作物之一,干旱影響植物的生長發(fā)育,造成10%-20%的作物減產(chǎn)。因此,研究小麥的抗旱機理對糧食增產(chǎn)具有重要意義。脫水素是胚胎發(fā)育晚期積累的蛋白之一,屬于熱穩(wěn)定的水溶性蛋白,它受寒冷、高溫、干旱以及鹽脅迫等逆境誘導,對保護生物代謝可能起到分子伴侶的作用,對細胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性起保護作用,從而減輕干旱對植物造成的傷害。wzy1-2基因是本實驗室從水分脅迫的鄭引1號小麥中克隆獲得的脫水素成員,為了進一步解析該基因的抗旱功能,我們采用RNA干擾技術(shù),在目的基因轉(zhuǎn)錄后可以剔除該基因的表達,得到缺失突變體,為基因功能研究提供材料。本文根據(jù)同源分析,在脫水素wzy1-2基因序列中選擇了298bp的cDNA序列作為干擾片段,將克隆的干擾片段插入高效植物干擾表達載體pTCK303的多克隆位點中,成功構(gòu)建含反向重復序列的RNA干擾表達載體。以鄭引1號小麥的幼胚為外植體,采用基因槍法轟擊2512個幼胚的愈傷組織,獲得再生植株26株,再生率為1.03%。利用表達載體上Hpt基因的特異引物,對所獲得26株T_0代再生植株進行PCR分析,檢測到6株Hpt基因陽性植株,Hpt基因陽性轉(zhuǎn)化率為0.24%。通過對目的基因?qū)崟r定量分析,目的基因表達量下降顯著。在制備轉(zhuǎn)基因材料的同時,我們研究了脫水素WZY1-2在小麥整個生長過程中4個不同生長時期(苗期、分蘗期、拔節(jié)期和開花期)的干旱處理的表達規(guī)律,為進一步了解該基因在小麥整個生長過程中表達模式。選取了兩個耐旱型不同的小麥品種,陜合6號和鄭引1號,在小麥生長的4個不同生長時期,進行干旱脅迫處理,觀察該基因的表達規(guī)律。結(jié)果表明,干旱程度越嚴重,小麥WZY1-2蛋白的表達量越高。苗期小麥WZY1-2蛋白的表達量均比其它3個生長時期高。Western blot結(jié)果表明,陜合6號和鄭引1號的非特異性條帶單一。從分子水平得出小麥WZY1-2是干旱誘導型基因。
【學位單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S512.1
【部分圖文】：

章 小麥脫水素 WZY1-2 干擾基因的用高速金屬微粒將外源基因?qū)胧荏w細胞的進入細胞后，其攜帶的外源基因得以表達，同8)。基因槍法的優(yōu)點是受體類型廣泛，既可以高度可控。缺點是外源基因拷貝數(shù)多，使外般低于 1%）、轉(zhuǎn)化體系不穩(wěn)定和成本高等(鄭引 1 號為供試材料，供試材料播種于陜西楊株的生長狀況好壞對能否成功轉(zhuǎn)化是至關(guān)重株保留 5 個分蘗。取幼胚進行試驗。小麥穎水。pMD18-T 載體（購自 Takara 公司，圖譜實驗保存，圖譜見圖 2-2）。各種限制性內(nèi)切

圖 2-2 pTCK303 植物表達載體Fig 2-2. pTCK303 plant expression vector儲存液成分種基本培養(yǎng)基儲存液的成分，包括大量元素、試劑、選擇試劑和瓊脂凝膠，以及最終使用表 2-1 大量元素S 大量(10×)/(g/L) L7 大量(10×)/(g/L)16.5 2.519.0 15.01.7 2.03.7 3.54.5 4.5121℃滅菌 20min 121℃滅菌 20mi4℃ 4℃

到合適大小(3~4 片葉)時，取葉片提取基因組 DCR 鑒定為陽性，將陽性苗移到 13cm2大小的塑成熟需要 3~4 個月。基因小麥中 wzy1-2 基因表達量的檢測RNA誘導的外源基因是否影響目的基因的mRN特異性地針對目的基因 mRNA 而設(shè)計的，用于因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物水平(王莉等. 2016)。為驗證試驗可(三個 cDNA)。分析總 RNA 的提取結(jié)果（圖 2-3）表明，Trizol 法提取的小麥總 RNA帶），無明顯降解，可以滿足反轉(zhuǎn)錄的要求。M 1 2

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本文編號：2831518