干旱是限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一個(gè)重要的環(huán)境因素,全球干旱、半干旱地區(qū)約占土地總面積的36%,占耕地面積的43%。我國(guó)干旱、半干旱地區(qū)面積約占全國(guó)土地面積的二分之一,主要分布于西北地區(qū)。小麥?zhǔn)侵饕Z食作物之一,干旱影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育,造成10%-20%的作物減產(chǎn)。因此,研究小麥的抗旱機(jī)理對(duì)糧食增產(chǎn)具有重要意義。脫水素是胚胎發(fā)育晚期積累的蛋白之一,屬于熱穩(wěn)定的水溶性蛋白,它受寒冷、高溫、干旱以及鹽脅迫等逆境誘導(dǎo),對(duì)保護(hù)生物代謝可能起到分子伴侶的作用,對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性起保護(hù)作用,從而減輕干旱對(duì)植物造成的傷害。wzy1-2基因是本實(shí)驗(yàn)室從水分脅迫的鄭引1號(hào)小麥中克隆獲得的脫水素成員,為了進(jìn)一步解析該基因的抗旱功能,我們采用RNA干擾技術(shù),在目的基因轉(zhuǎn)錄后可以剔除該基因的表達(dá),得到缺失突變體,為基因功能研究提供材料。本文根據(jù)同源分析,在脫水素wzy1-2基因序列中選擇了298bp的cDNA序列作為干擾片段,將克隆的干擾片段插入高效植物干擾表達(dá)載體pTCK303的多克隆位點(diǎn)中,成功構(gòu)建含反向重復(fù)序列的RNA干擾表達(dá)載體。以鄭引1號(hào)小麥的幼胚為外植體,采用基因槍法轟擊2512個(gè)幼胚的愈傷組織,獲得再生植株26株,再生率為1.03%。利用表達(dá)載體上Hpt基因的特異引物,對(duì)所獲得26株T_0代再生植株進(jìn)行PCR分析,檢測(cè)到6株Hpt基因陽(yáng)性植株,Hpt基因陽(yáng)性轉(zhuǎn)化率為0.24%。通過(guò)對(duì)目的基因?qū)崟r(shí)定量分析,目的基因表達(dá)量下降顯著。在制備轉(zhuǎn)基因材料的同時(shí),我們研究了脫水素WZY1-2在小麥整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中4個(gè)不同生長(zhǎng)時(shí)期(苗期、分蘗期、拔節(jié)期和開(kāi)花期)的干旱處理的表達(dá)規(guī)律,為進(jìn)一步了解該基因在小麥整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中表達(dá)模式。選取了兩個(gè)耐旱型不同的小麥品種,陜合6號(hào)和鄭引1號(hào),在小麥生長(zhǎng)的4個(gè)不同生長(zhǎng)時(shí)期,進(jìn)行干旱脅迫處理,觀察該基因的表達(dá)規(guī)律。結(jié)果表明,干旱程度越嚴(yán)重,小麥WZY1-2蛋白的表達(dá)量越高。苗期小麥WZY1-2蛋白的表達(dá)量均比其它3個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期高。Western blot結(jié)果表明,陜合6號(hào)和鄭引1號(hào)的非特異性條帶單一。從分子水平得出小麥WZY1-2是干旱誘導(dǎo)型基因。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：S512.1
【部分圖文】：

章 小麥脫水素 WZY1-2 干擾基因的用高速金屬微粒將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞的進(jìn)入細(xì)胞后，其攜帶的外源基因得以表達(dá)，同8)�；驑尫ǖ膬�(yōu)點(diǎn)是受體類(lèi)型廣泛，既可以高度可控。缺點(diǎn)是外源基因拷貝數(shù)多，使外般低于 1%）、轉(zhuǎn)化體系不穩(wěn)定和成本高等(鄭引 1 號(hào)為供試材料，供試材料播種于陜西楊株的生長(zhǎng)狀況好壞對(duì)能否成功轉(zhuǎn)化是至關(guān)重株保留 5 個(gè)分蘗。取幼胚進(jìn)行試驗(yàn)。小麥穎水。pMD18-T 載體（購(gòu)自 Takara 公司，圖譜實(shí)驗(yàn)保存，圖譜見(jiàn)圖 2-2）。各種限制性?xún)?nèi)切

圖 2-2 pTCK303 植物表達(dá)載體Fig 2-2. pTCK303 plant expression vector儲(chǔ)存液成分種基本培養(yǎng)基儲(chǔ)存液的成分，包括大量元素、試劑、選擇試劑和瓊脂凝膠，以及最終使用表 2-1 大量元素S 大量(10×)/(g/L) L7 大量(10×)/(g/L)16.5 2.519.0 15.01.7 2.03.7 3.54.5 4.5121℃滅菌 20min 121℃滅菌 20mi4℃ 4℃

到合適大小(3~4 片葉)時(shí)，取葉片提取基因組 DCR 鑒定為陽(yáng)性，將陽(yáng)性苗移到 13cm2大小的塑成熟需要 3~4 個(gè)月�；蛐←溨� wzy1-2 基因表達(dá)量的檢測(cè)RNA誘導(dǎo)的外源基因是否影響目的基因的mRN特異性地針對(duì)目的基因 mRNA 而設(shè)計(jì)的，用于因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物水平(王莉等. 2016)。為驗(yàn)證試驗(yàn)可(三個(gè) cDNA)。分析總 RNA 的提取結(jié)果（圖 2-3）表明，Trizol 法提取的小麥總 RNA帶），無(wú)明顯降解，可以滿足反轉(zhuǎn)錄的要求。M 1 2

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1 朱維寧;逆境脅迫下小麥脫水蛋白wzy1-2、wzy2基因及啟動(dòng)子的功能研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2014年

2 王曉宇;小麥非生物脅迫相關(guān)LEA蛋白WZY1-2與WRAB18的功能研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2017年

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2 齊玉紅;干旱脅迫下小麥脫水素WZY1-2、WZY2互作蛋白的篩選[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2018年

3 陸璇璇;小麥脫水素基因wzy1-2啟動(dòng)子的功能分析[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2013年

本文編號(hào)：2831518