目的:在小鼠的部分軟骨中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)節(jié)律現(xiàn)象的存在,然而對于時鐘節(jié)律在顳下頜關節(jié)(TMJ)中的作用及其及其機制我們尚仍不清楚。本研究旨在探究時鐘基因芳烴受體核轉(zhuǎn)位因子樣蛋白1(ARNTL/BMAL1)在炎性介質(zhì)白細胞介素-1β(IL-1β)誘導的炎性大鼠顳下頜關節(jié)髁突軟骨細胞中的作用及其可能存在的分子機制。方法:嚴格無菌的環(huán)境之下,從Wister大鼠的雙側顳下頜關節(jié)中取出髁突軟組織,并用含雙抗的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗兩次,然后將剝離下來的髁突軟骨切成1mm3大小的組織塊,在37℃條件下置于0.25%的胰蛋白酶中消化30min,然后再加入0.2%Ⅱ型膠原酶。待消化1-2h后,分離并培養(yǎng)原代髁突軟骨細胞,倒置光學顯微鏡下觀察軟骨細胞的增殖和形態(tài),并通過觀察細胞的形態(tài)、甲苯胺藍染色法以及Ⅱ型膠原免疫熒光染色法來鑒定軟骨培養(yǎng)結果。將培養(yǎng)至第二代姴突軟骨細胞隨機分成5組,分別用Ong/ml、lng/ml、5ng/ml、10ng/ml和100ng/ml濃度的IL-1β處理24小時。檢測β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、BMAL1、Ⅱ 型膠原蛋白(collagenⅡ,COL2)、蛋白多糖(Aggrecan,AGG)的mRNA表達量及蛋白含量的變化,觀察節(jié)律基因BMAL1在IL-1β誘導下的炎性髁突軟骨細胞中的表達變化,并選出能夠引起髁突軟骨細胞炎癥狀態(tài)的最佳的IL-1β濃度。然后再取第二代髁突軟骨細胞,將其隨機分為4組,分別是:對照組,軟骨細胞不做任何處理;IL-1β組,將軟骨細胞用濃度為10ng/ml的IL-1β處理24h;空白質(zhì)粒組,在軟骨細胞中加入空載質(zhì)粒孵育24h;BMAL1小干擾RNA(BMAL1 siRNA)組,將軟骨細胞加入含BMAL1siRNA的干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后孵育24h。熒光顯微鏡鏡下觀察BMAL1 siRNA的轉(zhuǎn)染情況。用Western印跡方法檢測各組BMAL1、β-catenin、COL2和AGG的蛋白表達變化。用實時定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測 BMAL1、β-catenin、COL2 和 AGG 的 mRNA 的表達變化。結果:(1)大鼠顳下頜關節(jié)髁突軟骨細胞成功提取并培養(yǎng)后,顯微鏡下觀察可見正常體外軟骨細胞形態(tài)呈規(guī)則的小圓形。孵育1天后,軟骨細胞大部分貼壁成功,顯微鏡下觀察可見細胞形態(tài)呈多邊形或星形;軟骨細胞培養(yǎng)4-5天后,鏡下可觀察到細胞呈“鋪路石”樣排列。一次傳代之后,貼壁細胞生長的速度加快;通過甲苯胺藍染色,發(fā)現(xiàn)髁突軟骨細胞呈紫紅色,背景呈淡藍色;II型膠原免疫熒光染色,胞漿內(nèi)可見有棕黃色顆粒(2)結果表明:隨著IL-1β濃度的改變,髁突軟骨細胞中COL2、AGG、β-catenin、BMAL1的表達均出現(xiàn)不同程度的改變,在IL-1β濃度為10ng/ml時,對髁突軟骨細胞的COL2和AGG的表達效果影響最為明顯,而且經(jīng)過IL-1β(10ng/mL)誘導的髁突軟骨細胞中BMAL1的表達顯著降低。(3)在下調(diào)了 BMAL1的表達后,Wnt/β-catenin經(jīng)典信號通路的關鍵蛋白β-catenin的表達增加,而COL2和AGG的表達量顯著降低,TMJ呈現(xiàn)出類似骨關節(jié)炎(OA)樣的改變。結論:節(jié)律基因在顳下頜關節(jié)髁突軟骨細胞中發(fā)揮重要作用。在IL-1β誘導的體外骨關節(jié)炎模型中抑制了節(jié)律基因BMAL1的表達;而另一方面節(jié)律性基因BMAL1表達的失衡會導致髁突軟骨細胞動態(tài)平衡的紊亂,從而引起TMJ出現(xiàn)OA樣變化,表明BMAL1可能對軟骨細胞有潛在的保護作用,而且這種改變可能通過Wnt/β-catenin信號通路發(fā)揮作用。本實驗初步探討了節(jié)律基因在顳下頜關節(jié)髁突軟骨細胞中的重要作用,為TMJ-OA的發(fā)生發(fā)展機制提供了潛在的研究方向,但需要更多的臨床研究來證實這一效果。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R782.6
【部分圖文】：

軟骨原代細胞提取、分離與培養(yǎng)步驟與大部分組織細胞步驟基們獲得的軟骨細胞生長狀況良好，形態(tài)正常，增殖旺盛，并且用免疫細胞化學染色鑒定了髁突軟骨細胞。逡逑外進行髁突軟骨細胞的培養(yǎng)過程中，我們發(fā)現(xiàn)第二代細胞形態(tài)良而在軟骨細胞培養(yǎng)４代之后發(fā)生形態(tài)學的改變，出現(xiàn)去分化的現(xiàn)四代以內(nèi)的髁突軟骨細胞，軟骨細胞的形態(tài)學特點和生物學特性，且能夠穩(wěn)定的表達，因此可以用于本實驗研究。逡逑

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【參考文獻】

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1 Jing Xie;Na Fu;Lin-Yi Cai;Tao Gong;Guo Li;Qiang Peng;Xiao-Xiao Cai;;The effects of interleukin-1β in modulating osteoclast-conditioned medium's influence on gelatinases in chondrocytes through mitogen-activated protein kinases[J];International Journal of Oral Science;2015年04期

本文編號：2831543